卵巢癌早期診斷和篩選(編輯修改稿)
2025-02-02 01:49 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 蛋白的流出組分。采用 Bradord試劑盒檢測(cè)餾分蛋白濃度。其余樣本 80℃ 保存待用。 ? 2）蛋白定量標(biāo)記： mL的預(yù)冷丙酮加入 300μL低豐度蛋白血清，見沉淀物形成。 4℃ 15 000 g離心 100 min，棄上清，沉淀室溫放置 20 min使丙酮揮發(fā)完全。然后加入 20μL溶解緩沖液充分混勻，使樣品充分溶解。每組樣品取 100μg，加入 2倍體積的還原劑，充分混合， 60℃ 孵育 1 h。管內(nèi)加入半胱氨酸封閉劑渦旋混合后室溫孵育 10min。按1∶ 30（胰酶 ∶ 蛋白質(zhì)）的比例向樣品管內(nèi)加入消化酶，渦旋混合，37℃ 孵育 16 h。 iTRAQ試劑室溫凍融，每管 iTRAQ試劑加入 70μL無水乙醇，渦旋混合，使之溶解后轉(zhuǎn)入樣品管。然后按照卵巢癌組加入質(zhì)量數(shù) 118Da和正常對(duì)照組 119Da的標(biāo)記分別加入樣品管，漩渦混勻，室溫孵育 1 h，真空冷凍干燥，去除標(biāo)記中的胰蛋白酶和未標(biāo)記的多肽； 基本思路和方法 ? 二氧化鈦富集磷酸化肽段： 稱取 1mg TiO2放入 50% ACN/% FA( 40μL)中，制成勻漿液，裝入 GELoader 槍頭中，用惰性材料塞緊。裝好的微柱依次用 40μL的 0． 1% FA，80% ACN/% TFA， 40μL 2的 300 mmol /L LA/80% ACN/% FA的溶液沖洗，將樣品注入微柱中，依次用 40μL 2 的 300 mmol /L LA/80% ACN/% FA， 40μL 80% ACN/% TFA，40μL H2O 洗脫，最后用 10μL 2 的 5% NH3H2O 收集，并用甲酸調(diào)至 pH 3；稱取 1 mg C18AQ 材料裝柱 ( 同上 ),將裝好的微柱依次用 40μL ACN， 40μL 2 的 50% ACN/% FA 溶液沖洗，再用 40μL 2 的% FA 溶液平衡微柱，將上述富集到的收集液上樣，再用 40μL 2 的 % FA 溶液脫鹽，最后用 20μL 2 的 50%ACN/%FA 溶液洗脫收集并旋干，再用10μL的 50% ACN/% FA 溶解； 基本思路和方法 ? 質(zhì)譜分析： 采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) LCMS/MS質(zhì)譜分析，濃縮的iTRAQ標(biāo)記樣本加入 2 mL稀釋液，調(diào)溶液 pH值低于
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