【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行 定性或定量分析。 雙抗體夾心 ELISA 1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。 2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。 洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。 3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。 4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。 在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原。 競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，從而反映出抗體的量 PCR引物的設(shè)計(jì)原則總述 ? 引物長度（ primer length） ? 產(chǎn)物長度（ product length） ? 序列 Tm值 (melting temperature) ? G+C含量（ position） ? 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) （ duplex formation and hairpin） ? 閱讀框 中文名稱： 質(zhì)粒 英文名稱： plasmid 質(zhì)粒是一類存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中，能獨(dú)立于染色體DNA而自主復(fù)制的共價(jià)，閉合，環(huán)狀 DNA分子，其大小通常在 1100kb范圍內(nèi)。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性 ? 具有對(duì)受體細(xì)胞的可移植性或親和性 ? 具有與特定細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)和整合位點(diǎn) ? 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) ? 具有合適的選擇性標(biāo)記 質(zhì)粒的改造和構(gòu)建：指導(dǎo)思想 1. 刪除不必要的 DNA區(qū)域，盡量縮小質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量，以提高外源DNA片段的裝載量。 2. 滅活某些質(zhì)粒的編碼基因，如促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌種間轉(zhuǎn)移的 mob基因，杜絕質(zhì)粒擴(kuò)散污染環(huán)境，保證 DNA重組實(shí)驗(yàn)的安全 3. 加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因，最好是雙重或多重標(biāo)記，便于檢測(cè)含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。 4. 在選擇性標(biāo)記基因內(nèi)引入具有多種限制性內(nèi)切酶識(shí)別及切割位點(diǎn)的DNA序列，同時(shí)刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)。 5. 根據(jù)外源基因克隆的不同要求，分別加裝特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件或用于表達(dá)產(chǎn)物親和層析分離的標(biāo)簽編碼序列。 6. 非結(jié)合型，即要求質(zhì)粒不會(huì)從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌。 ?腫瘤的發(fā)生不僅是分裂失控導(dǎo)致的細(xì)胞過度增生，同時(shí)也可能是細(xì)胞凋亡通路受阻，使本該死亡的細(xì)胞繼續(xù)存在而產(chǎn)生腫瘤，因此，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為目標(biāo)的技術(shù)已成為腫瘤治療的重要策略之一。細(xì)胞凋亡是存在于細(xì)胞中的自毀機(jī)制，細(xì)胞凋亡能夠使機(jī)體清除衰老和異常的細(xì)胞，在維持許多細(xì)胞功能方面起到重要作用。 ?1972年 kerr等首先提出“細(xì)胞凋亡”這一概念，是由體內(nèi)外因素觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)置的死亡程序誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，自己結(jié)束其生命的過程，具有嚴(yán)格的基因時(shí)控性和選擇性。生物體各種細(xì)胞的數(shù)量都是通過增殖與死亡之間的平衡來完成的。 細(xì)胞周期 ? 細(xì)胞周期 指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時(shí)間叫細(xì)胞周期時(shí)間。 ? ① G1期 (gap1)，指從有絲分裂完成到期 DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間。 ? ② S期 (synthesis phase)，指 DNA復(fù)制的時(shí)期，只有在這一時(shí)期 H3TDR才能摻入新合成的 DNA中。 ? ③ G2期 (gap2)，指 DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時(shí)間。 ? ④ M期又稱 D期 (mitosis or division)，細(xì)胞分裂開始到結(jié)束。 微管的功能 ? 細(xì)胞內(nèi)，微管以胞質(zhì)微管和紡錘體微管兩種形式存在，主要參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞器的定位、胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸及真核細(xì)胞的有絲分裂過程。 ? 細(xì)胞進(jìn)入分裂期，其胞質(zhì)微管解聚成微管蛋白后再組裝成紡錘體微管。 ? 在分裂后期，紡錘體微管牽引著姊妹染色單體從赤道面移向紡錘體的兩極。 ? 在有絲分裂結(jié)束后，紡錘體微管解聚再組裝成胞質(zhì)微管。 抗結(jié)核藥物的篩選 What is 結(jié)核病 ? ? 結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病。 ? 是青年人容易發(fā)生的一種慢性和緩發(fā)的傳染病。一年四季都可以發(fā)病， 15歲到 35歲的青少年是結(jié)核病的高發(fā)峰年齡。潛伏期4～ 8周。其中 結(jié)核桿菌 80％發(fā)生在肺部，其他部位 (頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼 )也可繼發(fā)感染。人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。傳染源是接觸排菌的肺結(jié)核患者。 結(jié)核桿菌 當(dāng)前抗結(jié)核治療藥物 Screen ing 臨床常用治療藥物 當(dāng)常規(guī)治療失敗后可使用二線抗結(jié)核藥物 臨床常用治療藥物及耐藥靶點(diǎn) 一線抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)的突變使原有藥物的作用蛋白構(gòu)像發(fā)生了改變 利福平，異煙肼，鏈霉素，乙胺丁醇和吡嗪酰胺 這些藥物不良反應(yīng)多、殺菌作用不強(qiáng)、療程必須使用６個(gè)月以上，患者依從性差。 卷曲霉素、乙硫異煙胺、對(duì)氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、環(huán)丙沙星、阿米卡星和卡那霉素 不良反應(yīng)較大，治療時(shí)間更長（１８～２４個(gè)月），花費(fèi)昂貴，治愈率也更低 2022年我國ＭＴＢ總耐藥率為４２．５％，其中初始耐藥率為２７ .９％