淋巴細胞的分離和功能檢測(編輯修改稿)
2025-01-04 10:43 本頁面
【文章內容簡介】 發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為胞內蛋白質和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應。如細胞變大、胞質增多、出現(xiàn)空泡、核質疏松、核仁明顯并轉化為淋巴母細胞，又稱淋巴細胞轉化試驗（ lymphocyte transformation test ,LTT) 絲裂原誘導的增殖反應 技術方法 1. 用 RPMI－ 10將 PBMC配成 1x106/ml的懸液。 2. 用 100g/ml的 PHA配制 1: 1:20和 1:40稀釋液。 3. 96孔板中選擇一行（共 12孔），每孔中加入100181。l細胞。指定每相鄰 3孔為一組。前 3組分別加入一種稀釋度的 PHA溶液，最后一組加培養(yǎng)液（對照組）。 4. 37176。C ， 5％ CO2， 54h。 5. 配制濃度為 50181。ci/ml的 3HTdR。 T細胞增殖功能測定 絲裂原誘導的增殖反應 6. 每孔加入 50181。ci 3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng) 18h。 7. 用多孔自動收集儀分別收集每孔細胞于一小管中。溶解細胞，將 DNA過濾到濾紙上，洗去未摻入的 3HTdR，最后用 100％的甲醇洗滌，以利濾紙干燥。 8. 將濾紙放入液閃管內，自動計數(shù)，打印結果。 9. 扣除本底，計算每一組 3個復本的平均數(shù)。 T細胞增殖功能測定 絲裂原誘導的增殖反應 影響因素 1. 細胞活力：冷凍技術影響細胞活力，復蘇后應檢查細胞活力。 2. 培養(yǎng)液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制細胞增殖。如欲測定人體細胞增殖能力，可采用滅活的 AB血清。 3. 細胞培養(yǎng)板類型：根據(jù)細胞數(shù)量采用不同形狀底部的培養(yǎng)板。 4. 微生物污染：可降低細胞增殖能力。 T細胞增殖功能測定 單向混合淋巴細胞培養(yǎng)反應 原理 T細胞受體能夠識別同種異型 MHC分子。當把 2個不同個體的單個核細胞在體外混合時，可以相互刺激，引起增殖。增殖的強度與兩者之間 MHC的差別的程度成正比。所以同種異型混合淋巴細胞反應的強度反映 2個個體之間 MHC差別的程度，并且因為相互識別與增殖，結果是 2個個體的淋巴細胞增殖能力的總和。這種試驗就是 雙向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗。 將參加反應之一方的單個核細胞用放射性核素照射，使其失去反應能力，但仍保存刺激能力，成為刺激細胞，則此時的反應結果僅反映另一方（反應方）的增殖能力。在實質性器官移植時，只需了解受者淋巴細胞對供者 MHC的反應能力，所以適合采用 單向混合淋巴細胞培養(yǎng)反應 。 T細胞增殖功能測定 單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗 方法 1. 分離宿主與供者的 PBMC，調整細胞濃度為 1 x 106/ml。 2. 刺激細胞滅活：用絲裂霉素（終濃度 25181。g ， 37 176。 C， 5％ C， 30min）或放射性核素照射（ 2022 rad）的方法處理刺激細胞。 3. 96孔板中，每孔加入 1x105的刺激細胞和 1x105反應細胞。 37176。 C， 5％ CO2， 4～ 6d。加 3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng) 18h。陽性對照孔加反應細胞和絲裂原，不加刺激細胞。陰性對照孔只加照射的自身細胞。3復本。 4. 收集細胞，液閃儀計數(shù)，打印結果。 T細胞增殖功能測定 單向混合淋巴細胞培養(yǎng) 5. 計算相對反應（ RR） （實驗組 cpm－陰性對照組 cpm） RR＝ 陽性對照組 cpm－陰性對照組 cpm T細胞增殖功能測定 單向混合淋巴細胞培養(yǎng) 注意點 1. 細胞活力：使用冷凍細胞時，復蘇后應檢查細胞活力。 2. 培養(yǎng)液中添加的血清：有的血清可能會刺激或抑制反應。 3. 本底應小于 2022 rpm，陽性對照組應大于20220 rpm。 T細胞增殖功能測定 成熟淋巴細胞 轉化淋巴細胞 抗原誘導的特異性增殖反應 原理 本試驗測定 T細胞在體外對某一特定抗原的特異性免疫應答能力。所用抗原可以是初次接觸的抗原，也可以是曾經免疫過的抗原。常用的測定回憶反應的抗原有純化蛋白衍生物（ PPD）和破傷風類毒素（ TT）。這 2種抗原都被常規(guī)列入計劃免疫接種范疇，成人應該對它們有回憶反應。在某些免疫缺陷病中，對它們的特異性回憶反應可減弱或消失。 T細胞增殖功能測定 抗原性刺激物： 破傷風類毒素 鏈球菌激酶 純化蛋白衍生物 白色鏈球菌 同種異型抗原（ HLA) 抗原誘導的特異性增殖反應 方法 （以 T細胞對破傷風類毒素刺激的增殖反應為例） 1. 分離 PBMC和 APC， APC用絲裂霉素或放射性核素處理。 2. 96孔板中每孔加入 1x105 PBMC和 1x104 APC。 3. 每孔中加入系列稀釋的破傷風類毒素溶液，不同孔中抗原終濃度分別為 0、 10和 20181。g/ml。每一種濃度設 3復本。 4. 37C176。 ， 5％ CO2， 6天。 5. 加 3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng) 18小時。計數(shù)。 T細胞增殖功能測
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