犬瘟熱診斷技術(shù)的研究進展-課程論文湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)(編輯修改稿)
2024-07-12 23:11 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 檢測試 紙條廣泛應(yīng)用 ,是基層獸醫(yī)站和寵物醫(yī)院確診犬瘟 熱最常用 的輔助手段。雖然其具有簡便、快速的特 點 ,但敏感性和特異性相對較低 ,其檢出率還有進一 步優(yōu)化的空間。 4 分子生物學(xué)檢測技術(shù) 4 .1 核 酸 雜 交 方 法 核酸雜交技術(shù)是一種根據(jù)堿基互補配對原理用 已知核酸來檢測未知核酸 ,以此來確定是否感染某 種疾病等的分子水平檢測技術(shù)。用于 CDV 診斷目 的的雜交雙方是已知序列的 CDV 探針和待測樣品 中的 CDV核酸 ,雜交后通過特定方法檢測 ,若有雜 交信號 ,則說明樣品中存在 CDV核酸 ,從而證明 CDV 感染的存在。該方法的關(guān)鍵是要制備敏感、穩(wěn) 定、特異的核酸 探針。核酸探針過去常用放射性同 位素進行標(biāo)記 ,放射性同位素標(biāo)記的優(yōu)點是敏感度 高 ,對被檢樣品處理要求不高 ,假陽性率低 ,其缺點 是半衰期短 ,費用 昂貴 ,需防護設(shè)備 ,放射自顯影時 間較長。近年來發(fā)展了非放射性標(biāo)記 ,如金屬汞、半 抗 原 、生 物 素 、酶 等 ,具 有 保 存 時 間 長 、檢 測 方 便 等 優(yōu) 點。國外對 CDV 核酸雜交技術(shù)方法的研究在 20世 紀(jì) 80 年 代 至 20 世 紀(jì) 90 年 代 較 多 [2224],近 年 來 未 見 專門報道。張永霞等 [25]采用斑點雜交法對 CDV N 基因進行地高辛 (DIG)標(biāo)記制備 cDNA 探針 ,用此 探針與樣品 (疑似犬瘟熱患病犬鼻液、病死犬脾臟、 肝臟、心臟、肺臟、腎臟、血液 )中 RNA 雜交檢測 CDV 基 因 ,試 驗 結(jié) 果 表 明 該 法 比 膠 體 金 診 斷 試 紙 檢 出率高 ,脾臟是最適宜的檢測樣本 ,斑點雜交技術(shù)在 CDV 早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查中有很高應(yīng)用價值。 巢 式 RTPCR (nested RTPCR) 巢 式 R T P C R 是 一 種 變 異 的 R T P C R , 使 用 兩 對 R T P C R 引 物 。 第 1 對 R T P C R 引 物 擴 增 片 段 和 普 通 R T P C R 相 似 。 第 2 對 引 物 稱 為 巢 式 引 物 (因 為 其 在 第 1 次 RTPCR 擴 增 片 段 的 內(nèi) 部 )結(jié) 合 在 第 1 次 RTPCR 產(chǎn) 物 內(nèi) 部 ,使 得 第 2 次 RTPCR 擴增片段短于第 1次擴增。巢式 RTPCR的好處 在于 ,如果第 1次擴增產(chǎn)生了錯誤片段 ,則第 2次能 在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因 此 ,巢 式 RTPCR 的 擴 增 非 常 特 異 。 楊 井 泉 等 [26]建 立 了 CDV 巢 式 RTPCR 檢 測 方 法 ,并 用 此 法 對 石 河子地區(qū)疑似感染 CDV的病料進行檢測 ,結(jié)果表 明該研究建立的巢式 RTPCR 不僅能有效檢測 CDV感染 ,而且能夠檢測多種組織樣品 ,補充了形 態(tài) 學(xué) 、理 化 和 生 物 學(xué) 鑒 定 的 不 足 ,減 少 RTPCR 的 誤檢率 ,適用于 CDV 的早期快速診斷和流行病學(xué) 調(diào)查。 Fischer等 [27]采用巢式實時熒光定量 RT PCR (RTnqPCR)方 法 分 別 對 疑 似 患 犬 瘟 熱 病 犬 的 血液、尿液、直腸黏膜拭子和結(jié)膜拭子進行檢測 ,結(jié) 果顯示血液的檢出率最高。該方法需經(jīng)過兩輪 PCR 反 應(yīng) ,與 普 通 RTPCR 反 應(yīng) 相 比 大 大 提 高 了 反 應(yīng)的特異性 ,比免疫層析技術(shù) (IC)的敏感性更高 , 同 時 又 采 用 限 制 性 片 段 長 度 多 態(tài) 性 (RFLP)分 析 技 術(shù)對擴增的 NC 基因核苷酸序列進行分析 ,以此來 確定是否為 CDV 野毒株感染。 Yi等 [28]建立用于 區(qū)分 CDV 野毒株與疫苗株的等位基因特異性 RT PCR方法 ,而采用病毒分離培養(yǎng)方法卻無法區(qū)分 , 該方法可用于 CDV 的臨床檢測和流行病學(xué)監(jiān)測 , 具有很強的特異性。 TaqMan 實 時 熒 光 定 量 RTPCR 和 SYBR Gre en I 實 時 熒 光 定 量 RTPCR 常規(guī) RTPCR僅對反應(yīng)的終產(chǎn)物進行定性定 量 分 析 ,而 實 時 熒 光 定 量 RTPCR 可 對 反 應(yīng) 中 每 一 循 環(huán) 進 行 定 性 定 量 分 析 ,與 常 規(guī) RTPCR 相 比 ,實 5 期 蘇 鳳 艷 等 :犬 瘟 熱 診 斷 技 術(shù) 的 研 究 進 展 1321 時熒光定量 RTPCR具有自動化程度高、操作簡 單、解決 PCR污染問題、特異性更強、靈敏度高、可 直 接 對 產(chǎn) 物 進 行 定 量 的 特 點 [2930]。 常 用 的 實 時 熒 光 定 量 PCR 試 劑 有 TaqMan 水 解 探 針 、SYBR Gre enI 和 分 子 信 標(biāo) 。 其 中 SYBR Gre enI 可 用 于 多 種 模 板 、靈 敏 度 高 、使 用 方 便 、價 格 相 對 便 宜 ,較 常 用 。TaqMan 探 針 特 異 性 高 ,是 只 有 引 物 和 探 針 都 與 同一模板結(jié)合時才能檢測 ,可在一次反應(yīng)中同時檢 測多個不同的序列 ,但該探針只適于一個特定的目 標(biāo) 。分子信標(biāo)可用于單核苷酸多態(tài)性的檢測 ,尤其適 用于檢測點突變 ,但該探針設(shè)計困難、價格昂貴 ,一般 不 用 。 全 傳 松 等
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