【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 滿足臨床診斷的要求，人們對(duì)磁共振成像的特異性、精確性、敏感性提出了更高的要求。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)微小病變及隱匿病變的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，學(xué)者紛紛投入到提高疾病診斷準(zhǔn)確性的成像方法的研究。雖然單一的磁共振成像設(shè)備已經(jīng)對(duì)脂肪、軟組織等低密度組織具有的成像效果，但它仍然不可以實(shí)現(xiàn)對(duì)全身任意組織的掃描成像并提供有診斷價(jià)值的圖像。通過(guò)磁共振和其他成像設(shè)備的徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 2 頁(yè) 結(jié)合（例如磁共振和 PET 的 結(jié)合形成 PETMRI） [1314]，多通道探測(cè)器可視化的開發(fā)，不僅可以從解剖水平觀察病變，而且可以從分子代謝水平研究病變組織的代謝情況從而定性診斷疾病。但是這樣的組合仍然存在許多固有的問題，如因多個(gè)成像器件空間分辨率及時(shí)間分辨率的圖像定位導(dǎo)致生物樣品的差異所造成的困難[15]。另一解決方案為：磁共振對(duì)比劑。磁共振對(duì)比劑的應(yīng)用更是極大地拓展了磁共振成像技術(shù)的臨床適用范圍。 磁共振造影劑是能夠縮短組織在外磁場(chǎng)作用下的共振時(shí)間、增大對(duì)比信號(hào)的差異、提高成像對(duì)比度和清晰度的一類診斷試劑 [16]。磁共振對(duì)比增強(qiáng)的基 本原理是通過(guò)改變內(nèi)、外界弛豫效應(yīng)和磁化率效應(yīng)間接地改變組織的信號(hào)強(qiáng)度，從而達(dá)到提高不同組織間信號(hào)差異的目的。磁共振對(duì)比劑的應(yīng)用，可以增強(qiáng)正常組織與病變組織之間的信號(hào)對(duì)比，使微小病變更加突出，使得微小病變與隱匿病變的早發(fā)現(xiàn)、早診斷成為可能。它能有效改變生物體內(nèi)組織中局部的水質(zhì)子弛豫速率，縮短水分子中質(zhì)子的弛豫時(shí)間，準(zhǔn)確地檢測(cè)出正常組織與患病部位之間的差異，從而最終顯示生物體內(nèi)各器官或組織的功能狀態(tài)。磁共振對(duì)比劑要應(yīng)用于人體，除了要滿足藥物的基本要求，具有生物適應(yīng)性、水溶性好和良好的穩(wěn)定性外，還應(yīng)具有以下特性： （ 1）靶向性：即對(duì)比劑進(jìn)入人體后能選擇性聚集，在靶組織富集并停留一段時(shí)間，使靶區(qū)域被觀測(cè)核的弛豫速率比其他正常組織部位有更大的增強(qiáng)，以達(dá)到增加正常組織與病變組織的對(duì)比度。（ 2）細(xì)胞毒性小：對(duì)比劑中游離的稀土金屬離子和配體毒性較強(qiáng)，而其配合物毒性較低。稀土金屬離子的置換效應(yīng)是毒副作用的主要影響因素，所以 MRI 對(duì)比劑在體內(nèi)的有效期中應(yīng)為穩(wěn)定配合物。（ 3）高的弛豫率：對(duì)比劑對(duì)水質(zhì)子的弛豫能力影響其在體內(nèi)磁共振成像的效果。弛豫能力越強(qiáng)，活體成像效果就越好。（ 4）在體內(nèi)有適當(dāng)?shù)拇媪魰r(shí)間：既為成像提供必要的時(shí)間，又易于 從體內(nèi)排出，不會(huì)在體內(nèi)積累。按增強(qiáng)類型不同，磁共振對(duì)比劑可以分為陽(yáng)性對(duì)比劑和陰性對(duì)比劑。 陽(yáng)性對(duì)比劑一般是指可以增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度的順磁性物質(zhì)，例如軋劑、氧化錳等。陽(yáng)性對(duì)比劑以縮短 T1弛豫時(shí)間為主（在 T1加權(quán)成像中增加信號(hào)的強(qiáng)度），表現(xiàn)在圖像上增強(qiáng)區(qū)顯示信號(hào)增強(qiáng)。在 T1加權(quán)像中，由公式 I=KN(H)(1eTR/T1)可知，如果組織器官的 T1短，則 MR 信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)，圖像變亮；如果組織器官 T1長(zhǎng)，則MR 信號(hào)強(qiáng)度弱，圖像變暗。目前應(yīng)用最廣泛的磁共振陽(yáng)性對(duì)比劑即 GdDTPA，中文名為二乙三胺五醋酸釓或釓噴酸葡甲胺鹽， 商品名為馬根維顯（ Magnevist）[1718]。 GdDTPA 是一種順磁性物質(zhì)，它的增強(qiáng)原理為： Gd3+具有 7 個(gè)不成對(duì)電子，其不成對(duì)電子與質(zhì)子一樣為偶極子，具有磁距。電子質(zhì)量很輕，但其磁距約為質(zhì)子的 657 倍。在無(wú)順磁性物質(zhì)的情況下，組織的 T1 弛豫是由質(zhì)子之間的偶極子 偶極子相互作用，形成局部磁場(chǎng)波動(dòng)所引起的。在有不成對(duì)電子的順磁性物質(zhì)存在時(shí)，由于電子的磁化率約為質(zhì)子的 657 倍，從而產(chǎn)生局部巨大磁場(chǎng)波動(dòng)。此時(shí)，大部分電子的運(yùn)動(dòng)頻率與 Larmor 頻率相近，而使鄰近質(zhì)子的 T1弛豫時(shí)間縮短，即形成所謂質(zhì)子偶極 子 電子偶極子之間的偶極子 偶極子相互作用，引起所謂質(zhì)徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 3 頁(yè) 子磁豫增強(qiáng)，其結(jié)果造成 T1弛豫時(shí)間縮短。在 GdDTPA 濃度較低時(shí)，由于機(jī)體組織的 T1 弛豫時(shí)間較長(zhǎng)，故對(duì)比劑對(duì)機(jī)體組織的 T1 弛豫時(shí)間影響較大。然而，隨著 GdDTPA 濃度增加， T2縮短效應(yīng)漸趨明顯。 GdDTPA 通過(guò)改變周圍氫核的磁性起作用，具有親水性、相對(duì)分子質(zhì)量小的特點(diǎn)，注入血管后迅速向周圍組織間隙分布，由腎臟排泄，對(duì)各系統(tǒng)的病變都有診斷與鑒別診斷的價(jià)值。雖然GdDTPA 被廣泛的應(yīng)用于臨床 [1922]，但存在很多的缺陷。 為了降低 Gd3+本身的毒性 ，人們采取制備釓離子螯合物的方式來(lái)提高對(duì)比劑的生物相容性。但螯合物的形成會(huì)降低對(duì)比劑的對(duì)比度，因?yàn)榕c水合釓離子的 89 個(gè)位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，釓離子螯合物中可與水質(zhì)子交換的配位點(diǎn)的數(shù)目只有 12 個(gè)。另一方面，絕大多數(shù)的釓對(duì)比劑的血液循環(huán)時(shí)間較短，對(duì)組織和細(xì)胞缺少選擇性，難于表面功能化也限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。同時(shí)，釓離子螯合物中的 Gd3+一旦去螯合或者與人體中存在的其他離子，如 Zn2+等，交換螯合后被釋放有可能會(huì)帶來(lái)潛在的毒性。而且有報(bào)道指出釓基對(duì)比劑會(huì)對(duì)生物體腎小管造成直接損害，引起腎細(xì)胞纖維化 [23]。 且絕大多數(shù)釓類小 分子對(duì)比劑都是離子型造影劑，體內(nèi)滲透壓較高，在體內(nèi)存留時(shí)間較短，易經(jīng)腎臟代謝后迅速排出，不具有組織或器官的選擇性，常常迅速滲透到細(xì)胞外液間隙而產(chǎn)生背景影像強(qiáng)化。 因此，如何開發(fā)具有靶向性、高弛豫效率、使用安全的對(duì)比劑是 MRI 研究的重點(diǎn)和主要發(fā)展方向之一。 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，關(guān)于納米粒子的研究越來(lái)越成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，許多納米材料的磁共振陽(yáng)性對(duì)比劑應(yīng)運(yùn)而生 [24]，例如： PEGGd2O BSA Gd2O3[2526]等。 由于納米粒子的特性，更易于進(jìn)行表面功能化與功能組裝，提高其靶向性 。使對(duì)比劑不僅具 可以輔助診斷，而且可以具有治療作用。 陰性對(duì)比劑通常是超順磁性的納米粒子（例如氧化鐵）及高濃度的順磁性物質(zhì)。陰性對(duì)比劑以縮短 T2弛豫時(shí)間為主（在 T2加權(quán)成像中降低信號(hào)強(qiáng)度），呈暗或黑色低信號(hào)。在 T2加權(quán)像中，由公式 I=KN(H)eTE/T2可知，如果組織器官 T2長(zhǎng)，則 MR 信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)，圖像變亮；如果組織器官 T2短，則 MR 信號(hào)強(qiáng)度弱，圖像變暗。超順磁性氧化鐵（ SPIO： Superparamagic Iron Oxide） 是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種納米材料 [27]， 由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在較弱的外磁場(chǎng)中就可產(chǎn) 生巨大的磁性，而外磁場(chǎng)撤銷后無(wú)剩磁。它的作用原理為： SPIO 顆粒直徑 40~400m，表面用葡聚糖包裹。由于血液中直徑在 30~5000nm 的顆粒主要經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，因而靜脈注射后 該類對(duì)比劑進(jìn)入肝臟及脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞 (RES：Reticuloendothelial system)，產(chǎn)生短 T2效應(yīng)，在肝臟枯否細(xì)胞可攝取對(duì)比劑顆粒。由于正常肝臟存在枯否細(xì)胞，而腫瘤內(nèi)一般無(wú)或少含無(wú)枯否細(xì)胞，因此對(duì)比劑能增加腫瘤與肝實(shí)質(zhì)間的對(duì)比，從而提高肝臟腫瘤的檢出率，對(duì)鑒別腫瘤是否肝細(xì)胞來(lái)源也有較大價(jià)值。目前有多種網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì) 胞性 MR 對(duì)比劑已經(jīng)商品化，如AMI25 和 Feridex（菲立磁） [28]等。 SPIO 納米粒子 由不同的外層材料包裹 三氧化二鐵或四氧化三鐵形成，其顆粒小，穿透力強(qiáng)，弛豫率為同條件下釓離子的 710倍，在很低濃度條件下即可在 MRI 形成對(duì)比 [29]。更重要的是， SPIO 納米粒子通過(guò)表面化學(xué)修飾可以進(jìn)一步結(jié)合特殊的抗體、氨基酸、蛋白或酶而具有吸收特異徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 4 頁(yè) 性 [30]。 但是， SPIO 納米粒子被細(xì)胞吸收后聚集于溶酶體中，在溶酶體低 的 pH 環(huán)境里，被分解成為鐵粒子，可用于合成血紅蛋白，因而在體內(nèi)具有低的毒性 [31]。 的提出 綜上所述，單一模態(tài)的磁共振對(duì)比劑，雖然在常見疾病的診斷上已經(jīng)發(fā)揮出巨大的作用，但是對(duì)于一些微小隱匿病變?nèi)匀粺o(wú)法提供具有高診斷準(zhǔn)確性的 MRI圖像。而且單模態(tài)對(duì)比劑毒性大，在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生非特異性聚集，使非病變組織產(chǎn)生增強(qiáng)的 MR 信號(hào)，從而導(dǎo)致高的非特異性背景和低目標(biāo)背景比。因此，單模態(tài)的磁共振對(duì)比劑正面臨巨大的挑戰(zhàn)。基于此，我們提出將陰性超順磁性納米粒子氧化鐵對(duì)比劑和陽(yáng)性 PEGGd2O3對(duì)比劑相結(jié)合的可激活磁共振對(duì)比劑。可激活對(duì)比劑具有高弛豫率、細(xì)胞毒性小、靶向性好、特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)。目前，關(guān)于可 激活對(duì)比劑的報(bào)道并不多，因此可激活對(duì)比劑成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。SPIO 和 PEGGd2O3 表面都含有羧基（ CO） ,通過(guò)表面含有兩個(gè)氨基（ NH）的胱胺相連接，當(dāng)沒有腫瘤細(xì)胞存在時(shí)，由于 SPIO 產(chǎn)生的磁場(chǎng)對(duì) PEGGd2O3的磁共振信號(hào)有淬滅作用，在磁共振 T1圖像上沒黑色或灰黑色，當(dāng)有腫瘤細(xì)胞存在時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞中谷胱甘肽（ GSH）含量比正常細(xì)胞高出許多，谷胱甘肽將連接 SPIO和 PEGGd2O3 的雙硫鍵打開，在磁共振 T1 圖像上表現(xiàn)為明亮或白色信號(hào)。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的靶向作用。提高診斷的準(zhǔn)確信和特異性。 論文第一章簡(jiǎn)要介紹了本實(shí)驗(yàn)的研究背景，且闡述了本文研究?jī)?nèi)容的提出。 論文第二章對(duì)陽(yáng)性對(duì)比劑 PEGGd2O3和陰性對(duì)比劑 SPIO 以及“連接物”胱胺的合成方法、性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的闡述和介紹。 論文第三章討論了可激活對(duì)比劑 Fe3O4SSGd2O3的制備過(guò)程及優(yōu)化。 論文第四章進(jìn)行了可激活對(duì)比劑 Fe3O4SSGd2O3的細(xì)胞毒性研究，利用 MTT法考察其生物相容性。 論文第五章：總結(jié)與展望。 徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 5 頁(yè) 2 材料合成 （ Fe3O4）納米粒子合成 引言 氧化鐵 ( 通常 指磁鐵礦 Fe3O4 或者磁赤鐵礦 γ － Fe2O3) 納米粒子，應(yīng)用于磁共振成像已有 20 多年的歷史了 。 超順磁性氧化鐵 ( SPIO，粒徑小于 30 nm) 納米粒子網(wǎng)狀內(nèi)皮組織吸收，在肝、脾、骨髓等組織會(huì)器官處富集會(huì)大大縮短 T2弛豫時(shí)間， SPIO 作為 T2 造影劑的典型代表，已經(jīng)臨床多年，如 Feridex IV Resovist Lumirem 進(jìn)行肝臟造影、追蹤成像等 [3236]。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，四氧化三鐵納米顆粒作為功能材料，在磁記錄材料、特殊催化劑原料、磁流體的基本材料和磁性顏料、藥物 等方面顯示出許多特殊功能，有關(guān)納米磁性Fe3O4的制備方法及性質(zhì)的研究也受到廣泛關(guān)注。 SPIO 納米粒子的合成方法有許多種，常用的有共沉淀法、微乳液法、超聲空氣法等 [3738]。其中，共沉淀法是制備 SPIO 納米粒子最常規(guī)的方法，也是較為簡(jiǎn)單和技術(shù)成熟的方法，它是將 二價(jià)鐵鹽和三價(jià)鐵鹽溶液按一定比例混合，將堿性沉淀劑快速加入至上述混合溶液中，攪拌、反應(yīng)一段時(shí)間經(jīng)洗滌、干燥，可得 SPIO 粉末。 SPIO 為符合氧化物，是由相應(yīng)的氫氧化物轉(zhuǎn)化而來(lái)，因此該反應(yīng)的理論摩爾比為 Fe2+： Fe3+： OH=： ：，但是由于實(shí)反應(yīng)中二價(jià)鐵離子易氧化成三價(jià)鐵離子，所以實(shí)際反應(yīng)中二價(jià)鐵離子應(yīng)當(dāng)適當(dāng)過(guò)量 [39]。本文在制備 Fe3O4的基礎(chǔ)上，又對(duì)已經(jīng)制備的納米探針進(jìn)行了 TEM 掃描， 磁共振信號(hào)響應(yīng) ，傅里葉紅外光譜分析 以檢驗(yàn)制備的納米粒子是否符合作為對(duì)比劑的要求 。 實(shí)驗(yàn)試劑及器材 （ 1）所用材料： 試劑：二氯化鐵 FeCl2（上海山海工學(xué)團(tuán)實(shí)驗(yàn)二廠）； 三氯化鐵 FeCl3（滬試，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 氨水（滬試，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 檸檬三鈉（滬試，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 溴化鉀。 材料： EP 管 、移液器槍頭、一次性吸管（ 美國(guó) AXYGEN 公司 ） （ 2）所用器材： 智能恒溫定時(shí)磁力攪拌器，型號(hào)： B123（上海司樂儀器有限公司）； 超純水儀（美國(guó)， MilliQ Refereme）； 舒美超聲波清洗器，型號(hào)： KQ218（昆山市超聲儀器有限公司）； 電子天平，（上海精密科學(xué)儀器有限公司）； 10μL、 20 mL、 100 mL、 1000 mL 微量移液器，（ 德國(guó) Eppendorf 公司 ）； 徐州醫(yī)學(xué)院 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 6 頁(yè) 電熱恒溫干燥箱 ，（ 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 ）； 精密增力電動(dòng)攪拌器，型號(hào)： JJ1（常州國(guó)華電器有限公司）； 紅外光譜儀 ，型號(hào)： NEXUS870 （ 美國(guó) Nicolet 公司 ）； 透射電子顯微鏡 TECNAI G2，（ 美國(guó) FEI 公司 ）； signal 全身磁共振成像設(shè)備 ，（ 美國(guó) GE 公司 ）。 實(shí)驗(yàn)步驟 （ 1）稱取 FeCl2溶于 10mL 蒸餾水，稱取 FeCl3溶于 10mL蒸餾水，并用超聲儀將之混合均勻； （ 2）用一次性吸管將混合均勻的兩溶液加入三口燒瓶中， 30 度水浴加熱； （ 3）在機(jī)械攪拌作用下，用恒壓滴液漏斗慢 慢將 濃氨加入； （ 4）氨水加完后，繼續(xù)劇烈攪拌 30min，在滴加氨水的過(guò)程中，可以看到溶液的顏色由橘紅色逐漸變黑色； （ 5）用磁鐵將 Fe3O4納米粒子吸出，用雙蒸水純化，直到 PH=； （ 6）在 60 攝氏度下真空干燥 24 小時(shí)，研磨得到 Fe3O4納米粒子。 透射電子顯微鏡（ TEM： Transmission electron microscope）掃描 將 SPIO 納米粒子用雙蒸水配制成 10