【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 值的重要因子，研究 miRNA 與植物抗病害作用機(jī)制對(duì)于園藝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要理論意義。本課題組發(fā)現(xiàn)草莓微繁殖苗對(duì)白粉病抗性比普通苗低，同時(shí) miR390 的表達(dá)量也大幅度下降，實(shí)時(shí)定量 RTPCR 檢測(cè)白粉病抗性強(qiáng)品種 miR390表達(dá)量，結(jié)果顯示它比白粉病抗性低的品種的表達(dá)量高出很多， miR390 與靶基因 TAS3沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 5 差異表達(dá)分析顯示 miR390 正調(diào)控 TAS3 表達(dá)，而在 2021 年， Allen 等人已發(fā)現(xiàn) miR390間接調(diào)控 ARF2/3/4 的表達(dá)，所以推測(cè)草莓 miR390 也通過(guò) TAS3 基因負(fù)調(diào)控 ARF 基因影響草莓對(duì)白粉病的抗性 [29]。 草莓 miRNA 研究進(jìn)展 目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于草莓 miRNA 的研究報(bào)道并不多， miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)了大量園藝植物 miRNA，如番木瓜（ Carica papaya） 81 個(gè)，甘藍(lán)（ Brassica oleracea） 11 個(gè)，番茄（ Solanum lycopersicum） 110 個(gè)，葡萄（ Vitis vinifera） 186 個(gè)，蘋(píng)果（ Malus domestica）207 個(gè)等，但是草莓的幾乎沒(méi)有， 2021 年以后 miRNA 研究進(jìn)程迅速。李賀 [30]用 miRNA基因芯片技術(shù)，在栽培草莓 ?豐香 ?植株內(nèi) 檢測(cè)到 74 個(gè) miRNA，其中有 46 個(gè) miRNA 來(lái)自 miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)，屬于 21 個(gè)家族； Dong 等 [31]分析了森林草莓 EST（序列標(biāo)簽） 47890個(gè)序列，計(jì)算機(jī)識(shí)別出 11 個(gè)候選 miRNA，來(lái)自 5個(gè)家族，通過(guò)特異性 539。及 339。 miRNA RACE PCR 和序列直接克隆法分析了栽培草莓 ?甜查理 ?（ Sweet Charlie） 5 個(gè)候選 miRNA（ miR156a、 miR159a、 miR39 miR858 及 miR408a）精確序列， qRTPCR 發(fā)現(xiàn)它們?cè)诓葺L(zhǎng)期不同器官與組織中表達(dá)存在差異； Ge 等 [32]高通量測(cè) 序檢測(cè)出 ?甜查理 ?草莓153 個(gè)已知 miRNA 及 37 個(gè)新 miRNA，靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)顯示它們?cè)谏L(zhǎng)發(fā)育及病害防御方面有重要作用； Han 等 [33]對(duì)森林草莓序列進(jìn)行精確分析，預(yù)測(cè)出 59 個(gè)新 miRNA，屬于 40 個(gè)家族，特異性 539。及 339。 miRNA RACE PCR 和序列直接克隆法在 ?甜查理 ?草莓中分析出 34 個(gè) miRNA 精確序列，其中 16 個(gè)未見(jiàn)報(bào)道， qRTPCR 數(shù)據(jù)顯示它們根、葉、莖、花、果實(shí)中表達(dá)存在差異，靶基因分析數(shù)據(jù)也顯示它們與草莓生長(zhǎng)發(fā)育有重要關(guān)系。 草莓果實(shí)品質(zhì)是影響草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，但是關(guān)于 miRNA 與果實(shí)發(fā)育及成熟的研究是有限的。草莓果實(shí)由瘦果及花托兩部分構(gòu)成， Nitsch[34]發(fā)現(xiàn)果實(shí)早期發(fā)育階段，生長(zhǎng)素能夠促進(jìn)瘦果及花托生長(zhǎng)， Manning[35]檢測(cè)到綠果期生長(zhǎng)素在兩者中達(dá)到峰值，隨著果實(shí)成熟而下降。 Li 等人 [36]研究發(fā)現(xiàn)草莓 ?幸香 ?白色果肉突變體中， miR399表達(dá)量比其野生型低很多，分析 miR399 可能與果實(shí)糖含量呈負(fù)相關(guān)，高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)在其野生型及白色果肉突變體中有 9 個(gè)新 miRNA 表達(dá)存在差異，初步預(yù)測(cè)其與果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。 相對(duì)于模式植物擬南芥及水稻來(lái)說(shuō)，草莓 miRNA 研究仍有很 大發(fā)展空間，因此基于分子生物學(xué)理論的草莓育種及草莓果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育研究前景廣闊，對(duì)今后的草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要指導(dǎo)意義。 本課題研究目的及意義 草莓是薔薇科草莓屬植物。草莓果實(shí)風(fēng)味酸甜，汁液多，外觀漂亮 ，因 而引起廣大人們的青睞，栽培面積越來(lái)越廣，因此草莓果實(shí)品質(zhì)是影響草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，但是關(guān)于草莓 miRNA 的研究并不多。 Shulaev 等 [37]對(duì)森林草莓（ Fragaria vesca）基因組進(jìn)行測(cè)序，現(xiàn)已被用作分子生物學(xué)和基因組研究的模型物種。 Li 等 [38]利用高通量測(cè)序技術(shù)在 ?幸香 ?野生型及白色果肉 突變體草莓中鑒定出來(lái)自27 個(gè)家族的 120 個(gè)保守 miRNA， 33 個(gè)新 miRNA，其中 9 個(gè)新 miRNA 在兩者中表達(dá)有差異，預(yù)測(cè)它們可能在草莓果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中起重要調(diào)控作用。本課題旨在用 RTPCR 方法選擇驗(yàn)證 15 個(gè)新 miRNA 在栽培草莓不同組織中的表達(dá)，進(jìn)而可以對(duì) miRNA 功能進(jìn)行深入研究， 預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)， 為以后草莓育種及豐產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。草莓新 microRNA 的 RTPCR 鑒定及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 6 2 材料與方法 植物材料 植物試材：栽培草莓（ F.ananassa） ?艷麗 ?，栽培于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)草莓試驗(yàn)基地，常規(guī)栽培管理。采取幼嫩葉片、成熟葉、匍匐莖、花托、萼片、幼果 等器官，液氮速凍后存于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)學(xué)科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱中。 主要試劑 RNasefree DNase I（ 5 181。181。L 1）、 RNase Inhibitor（ 40 181。181。L 1）、 dNTPs（ mmolL10 mmolL1）、 AMV（ 5 181。181。L 1）、 Ex Taq DNA 聚合酶（ 5 181。181。L 1）、 10Loading Buffer、Random 9 mers 及 Oligo d（ T） 18均購(gòu)自 TaKaRa 公司； 50bp Ladder DNA marker 購(gòu)自北京天 根生物技術(shù)有限公司。其它藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。 試驗(yàn)方法 草莓組織總 RNA 提取 參照 Chang 等 (2021)的 CTAB 法，稍加改良后提取草莓組織。 1) 預(yù)熱 2% CTAB 提取緩沖液 600 181。L（ 2% CTAB 588 181。L， β巰基乙醇 12 181。L）。 2) 取草莓組織（約 g）在液氮中研碎，迅速移入 mL 離心管中。加入預(yù)熱的RNA 提取緩沖液， 65176。C 水浴鍋中保溫 20min（幼果 15min），期間用力搖勻幾次。 3) 加入 600 181。L 氯仿，用力搖勻 5 min， 10000 rpm 離心 10 min。 4) 取上清液（約 450 181。L）移入新的離心管，加入等體積的氯仿抽提，用力搖勻 5 min，10000 rpm 離心 10 min。 5) 取上清液（約 300 181。L）移入新的離心管，加入 1/4 體積的 10 M LiCl（ 75 181。L），顛倒混勻， 20176。C 放置 1 h（可過(guò)夜）， 10000 rpm 離心 10 min。 6) 棄上清，加入 360 181。L DEPC 水，沉淀溶解后 10000 rpm 離心 10 min。取出 300181。L移入新的離心管，加入 1 181。L RNase Inhibitor， Buffer 10 181。L ， 4 181。L RNasefree DNase I，輕輕混勻后于 37176。C 水浴 4 h。 7) 加入 315 181。L 氯仿，用力搖勻 5 min， 10000 rpm 離心 10 min。 8) 取上清液（約 200 181。L）加入 1/10 體積的 3 M NaAc（ pH =， 20 181。L）， 倍體積冰冷的無(wú)水乙醇（ 20 176。C 存放， 550 181。L），顛倒幾次，混勻后 –20176。C 放置 30 min， 10000 rpm 離心 10 min。 9) 棄上清，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀 1 次，在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干 RNA 1 min，加入 30 181。L DEPC 水溶解沉淀備用。 RNA 的質(zhì)量及純度檢測(cè) 取 1 181。L RNA 提取樣品，加入 10Loading Buffer 2 181。L。混勻后，用含 EB（ 181。gmL1）的 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA 的完整性。用核酸蛋白分析儀檢測(cè) RNA 含量和質(zhì)量，操作如下： 先用超純水調(diào)零，取 1 181。L RNA 提取樣品，然后將待測(cè)樣品轉(zhuǎn)入比色杯中，讀取OD260 及 OD260 / OD280 的兩項(xiàng)數(shù)值。根據(jù) OD260值計(jì)算 RNA 含量， OD260 / OD280 比值代表核酸的純度。 OD260 / OD280 值在 ~ 之間時(shí)說(shuō)明 RNA 提取樣品純度較好； OD260 / OD280 值小于 時(shí)說(shuō)明 RNA 提取樣品中蛋白雜質(zhì)較多； 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 7 OD260 / OD280 值大于 時(shí)說(shuō)明 RNA 提取樣品已經(jīng)降解； OD260 / OD280 值小于 時(shí)說(shuō)明 RNA 提取樣品中有 β巰基乙醇的殘留。 RNA 的終濃度為（ 181。gmL 1） =OD260稀釋倍數(shù) 40 181。gmL1。 草莓新 miRNA 的 RTPCR 驗(yàn)證 1） RT 反應(yīng) 參照 Lu 等（ 2021）與 Chen 等（ 2021）的引物設(shè)計(jì)原則及方 式，自行設(shè)計(jì) 15 種新miRNA 的 RT 及 PCR 引物，委托于 TaKaRa 公司合成， 引物序列見(jiàn)下表。反應(yīng)在 mL小 PCR 管中進(jìn)行，體系如下： RNA 181。L DEPC 水 181。L dNTP(10 mmolL1) 181。L RT 引物 181。L 混勻后 65℃ 變性 5min，之后迅速置于冰上，繼續(xù)加入： RNase Inhibitor 181。L 5AMV Buffer 181。L AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 181。L 總體系 181。L 執(zhí)行以下程序： 16℃ 30 min； 20℃ 30 s， 42℃ 30 s， 50℃ 1 s， 60 個(gè)循環(huán)； 85℃ 反應(yīng) 10 min 結(jié)束，最后 4℃ 保存。 2） PCR 反應(yīng) 反應(yīng)程序如下： 執(zhí)行以下程序： 95℃ 10 min； 55℃ 2 min； 95℃ 1 s， 65℃ 1 min， 35 個(gè)循環(huán)； 72℃ 延伸 5 min 結(jié)束，最后 4℃ 保存。 PCR 產(chǎn)物中加入 10Loading Buffer 2 181。L，用 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶與 50 bp DNA Ladder Marker 對(duì)照，紫外燈下觀察拍照。 cDNA 181。L dNTP( mmolL1) 181。L PCR 正義引物 181。L PCR 反義引物 181。L Ex Taq Buffer 181。L Ex Taq 酶 181。L 超純水 181。L 總體系 181。L 草莓新 microRNA 的 RTPCR 鑒定及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 8 表 1 采用莖環(huán)引物鑒定 miRNA 的引物序列 Table 1 Stemloop RT primers and PCR primers for identifing miRNAs 名稱(chēng) 序列（ 5′→3′ ） name Sequence(5′ to 3′) FanmiR 1 stemloop RT primer ctcaactggttcgtggagtccggcaattcagttgagtccgccga PCR primer Forward: acactccagctgggcggaaactgg FanmiR 3 stemloop RT primer ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagccgccaaa PCR primer Forward: acactccagctgggcggaaaactg FanmiR 4 stemloop RT primer ctcaactggtgtcgtggaggtccggcaattcagttgagaatgcttc PCR primer Forward: acactccagctgggtattggcaga FanmiR 5 stemloop RT primer ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagccgccgaa PCR primer Forward: acactccagctgggcgaaaaactg FanmiR 6 stemloop RT primer ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgaggagccttt PCR primer Forward: acactccagctgggttcgtgatct FanmiR 7 stemloop RT primer ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgaggccgccga PCR primer Forward: acactccagctgggcggaaactga FanmiR 10 stemloop RT primer ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagatgctagt PCR primer Forward: acactccagctgggcaggttgtga FanmiR 11 stemloop RT primer atcaactggtgtcgtggaggtccggcaattcagttgagccgccaaa PCR primer Forward: acactccagctgggcggaaaacta FanmiR