【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 等無(wú)標(biāo)記的蛋白質(zhì)傳感器，通過傳感器綜合優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高通量、高靈敏、 高選擇性檢測(cè)，并開展癌癥早期診斷應(yīng)用研究。 課題 3 基于核酸適配體的蛋白質(zhì)分離與富集新技術(shù)研究 參加單位： 南京大學(xué)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，湖南大學(xué) 負(fù)責(zé)人：許丹科教授 學(xué)術(shù)骨干：練鴻振教授，張曉兵教授，余曉冬副教授，王小明副教授 經(jīng)費(fèi)比例： 22% 研究目標(biāo)： 以課題 1篩選的核酸適配體及其分子識(shí)別基礎(chǔ)研究為依據(jù)，建立以微流控學(xué) 與微納米分離為基礎(chǔ)的生物親和分離技術(shù)； 建立高容量、自動(dòng)化、高度重復(fù)性的 低豐度蛋白質(zhì)的高效富集方法以及高豐度蛋白的無(wú)偏去除方法；通過泛素化、磷 酸化、糖基化等翻譯后修飾基團(tuán)的核酸適配體，建立相關(guān)翻譯后修飾蛋白組的選 擇性富集方法。同時(shí)，針對(duì)癌癥早期診斷應(yīng)用開展蛋白質(zhì)標(biāo)志物分離與鑒定技術(shù) 研究。 主要研究?jī)?nèi)容： 1．微納米載體上核酸適配體負(fù)載技術(shù)：通過核酸適配體末端的生物素、巰 基、氨基等化學(xué)修飾基團(tuán)，利用微珠表面修飾親合素、納米金與羧基，發(fā)展對(duì)應(yīng) 的微納米載體表面核酸適配體的固定技術(shù)。研究微球表面的核酸適配體的修飾密 度，通過理論與實(shí)驗(yàn)分析其理論容量。 2. 蛋白質(zhì)微納米分離技術(shù)：通過負(fù)載核酸適配體的微納米顆粒，建立高豐 度蛋白去除、低豐度蛋白富集的磁分離、離心分離、超濾分離、柱分離等技術(shù)。 通過鹽濃度、 pH、溫度、變性劑等條件的調(diào)節(jié)，考察核酸適配體吸附蛋白的洗 脫與微珠的再生條件，研究提高蛋白質(zhì)富集與去除的重現(xiàn)性的方法。 3．蛋白質(zhì)富集的微流控芯片技術(shù)：制備 PDMS的微流控芯片，通過在芯片 上核酸適配體的固定與樣品混合物的循環(huán)流動(dòng)進(jìn)行低豐度的蛋白質(zhì)富集捕獲。優(yōu) 化流路尺寸、核酸適配體固定模式，研究流路 與流體控制對(duì)富集捕獲效率的影響， 實(shí)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)的高效率、自動(dòng)化的富集，并開展癌癥早期診斷應(yīng)用研究。 4. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的捕獲富集技術(shù)：針對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化、泛素化、糖基 化等免疫原性很低的翻譯后修飾，設(shè)計(jì)磷酸化氨基酸、泛素與糖分子等靶分子體 系，篩選翻譯后修飾基團(tuán)的核酸適配體，結(jié)合微流控學(xué)與微納米分離技術(shù)，建立 翻譯后修飾蛋白組的捕獲與富集方法。 課題 4 重大疾病蛋白質(zhì)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)新方法研究 參加單位： 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，蘇州大學(xué)，中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所 負(fù)責(zé)人：馬潔研究員 學(xué)術(shù) 骨干：宋詠梅副研究員，王成鋒主任醫(yī)師，劉祥軍副研究員，彭睿副教授 經(jīng)費(fèi)比例： 27% 研究目標(biāo)： 以課題 3的核酸適配體篩選及蛋白質(zhì)分離與檢測(cè)新方法為依據(jù)，篩選 針對(duì)肝癌、食管癌的特異性核酸適配體分子，建立基于核酸適配體的肝癌、食管 癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)與甄別技術(shù)；同時(shí)，針對(duì)癌癥早期診斷應(yīng)用，建立用于腫瘤 早期診斷和分型診斷的核酸適配體分子識(shí)別圖譜，并為惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的 研究提供新技術(shù)。 主要研究?jī)?nèi)容： 1. 不同來源腫瘤樣本特異性核酸適配體圖譜篩選：以食管癌、肝癌為例， 利用細(xì)胞、組織等復(fù)合靶標(biāo)以及相應(yīng)的對(duì)照樣品，篩選腫瘤特異性的核酸適配體 分子。 2．蛋白質(zhì)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證：通過與病變體系特征的蛋白質(zhì)標(biāo)志物對(duì)應(yīng) 的核酸適配體分離與富集蛋白質(zhì)標(biāo)志物，并利用質(zhì)譜與核磁譜技術(shù)鑒定相關(guān)的蛋 白標(biāo)志物。同時(shí)，利用基于核酸適配體的分子成像技術(shù)與流式細(xì)胞技術(shù)，開展標(biāo) 志物驗(yàn)證研究。 3. 食管癌、肝癌的早期診斷和分型診斷：對(duì)大量早期食管癌、肝癌患者、 健康對(duì)照人群血清樣本檢測(cè)，結(jié)合臨床病歷資料，探討特異性核酸適配體作為惡 性腫瘤早期診斷指標(biāo)的價(jià)值。利用不同亞型和分 期的食管癌、肝癌病理標(biāo)本檢測(cè) 核酸適配體分子識(shí)別圖譜在腫瘤分型診斷中的臨床意義。將適用于分型診斷的核 酸適配體用于血清樣本的檢測(cè)，評(píng)估其在早期惡性腫瘤患者分型診斷中的意義。 4. 腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究：以裸鼠為宿主，建立食管癌、肝癌裸鼠移植 瘤模型，將癌細(xì)胞懸液皮下種植于裸鼠背部，待腫瘤生長(zhǎng)一定體積后用于實(shí)驗(yàn)。 利用活體成像方法考察所發(fā)展的核酸適配體探針對(duì)裸鼠接種成瘤后癌細(xì)胞的識(shí) 別能力，通過在體、解剖和離體研究手段，考察腫瘤在裸鼠體內(nèi)各臟器的分布及 其隨時(shí)間的變化情況，揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分 子機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 系 列 DNA 或 RNA 文庫(kù)的合成；針 對(duì)肝癌、食道癌相關(guān)蛋白的核酸適配 體的初步篩選；肝癌食道癌細(xì)胞系、 組織樣品以及反篩選樣品的制備。針 對(duì)肝癌、食道癌細(xì)胞的核酸適配體初 步篩選。 以核酸適配體的 分子識(shí)別效應(yīng)與 構(gòu)象變化效應(yīng)為基礎(chǔ)，結(jié)合納米生物 技術(shù)，研究核酸適配體的非共價(jià)標(biāo)記 技術(shù)。探索基于各類集聚效應(yīng)的信號(hào) 傳導(dǎo)新技術(shù)。 開展適配體在微納分離材料表面 組裝性質(zhì)的研究，發(fā)展對(duì)應(yīng)的微納米 載體表面核酸適配體的固定技術(shù)，開 展適配體核酸堿基及分子結(jié)構(gòu)的改 造研究，系統(tǒng)研究多種固定載體與適 配體仿生界面制備的規(guī)律；開展磁性 微納顆粒分離技術(shù)和新型適配體負(fù) 載微納米粒子材料的研究。 發(fā)展通過細(xì)胞或組織篩選進(jìn)行高 通量的蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的新方法 設(shè)計(jì)與合成 5 個(gè) DNA 或 RNA 文 庫(kù)；初步富集到可識(shí) 別肝癌、食道癌 相關(guān)蛋白的核酸適配體庫(kù)一個(gè)；初步 富集到可識(shí)別肝癌、食道癌細(xì)胞的核 酸適配庫(kù) 2 個(gè)。 構(gòu)建基于非共價(jià)標(biāo)記的核酸適配體 分子探針。 實(shí)現(xiàn)適配體在微納材料表面的高效 結(jié)合，為適配體仿生識(shí)別界面的建立 提供理論指導(dǎo)和有效方法。建立快 速、高效的磁性分離平臺(tái)，建立低豐 度蛋白的快速富集與檢測(cè)技術(shù)。 建立基于核酸適配體的蛋白標(biāo)志物 富集與鑒定方法。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 克隆與表征特異性識(shí)別肝癌、食道 癌相關(guān)蛋白及癌細(xì)胞的核酸適配體， 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與冗余序列的剪裁，進(jìn) 行識(shí)別機(jī)理的 研究；進(jìn)一步篩選針對(duì) 肝癌、食道癌組織和血清樣品的核酸 適配體。 獲得 23 種特異性識(shí)別肝癌、食道癌 相關(guān)蛋白核酸適配體；獲得 34 種特 異性識(shí)別肝癌或食道癌細(xì)胞和組織 的核酸適配體。 利用核酸適配體與靶蛋白結(jié)合時(shí)的 構(gòu)象互變性質(zhì)，發(fā)展非標(biāo)記的蛋白質(zhì) 四、年度計(jì)劃 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 系 列 DNA 或 RNA 文庫(kù)的合成；針 對(duì)肝癌、食道癌相關(guān)蛋白的核酸適配 體的初步篩選；肝癌食道癌細(xì)胞系、 組織樣品以及反篩選樣品的制備。針 對(duì)肝癌、食道癌細(xì)胞的核酸適配體初 步篩選。 以核酸適配體的 分子識(shí)別效應(yīng)與 構(gòu)象變化效應(yīng)為基礎(chǔ)，結(jié)合納米生物 技術(shù)，研究核酸適配體的非共價(jià)標(biāo)記 技術(shù)。探索基于各類集聚效應(yīng)的信號(hào) 傳導(dǎo)新技術(shù)。 開展適配體在微納分離材料表面 組裝性質(zhì)的研究，發(fā)展對(duì)應(yīng)的微納米 載體表面核酸適配體的固定技術(shù)，開 展適配體核酸堿基及分子結(jié)構(gòu)的改 造研究，系統(tǒng)研究多種固定載體與適 配體仿生界面制備的規(guī)律；開展磁性 微納顆粒分離技術(shù)和新型適配體負(fù) 載微納米粒子材料的研究。 發(fā)展通過細(xì)胞或組織篩選進(jìn)行高 通量的蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的新方法 設(shè)計(jì)與合成 5 個(gè) DNA 或 RNA 文 庫(kù)；初步富集到可識(shí) 別肝癌、食道癌 相關(guān)蛋白的核酸適配體庫(kù)一個(gè)；初步 富集到可識(shí)別肝癌、食道癌細(xì)胞的核 酸適配庫(kù) 2 個(gè)。 構(gòu)建基于非共價(jià)標(biāo)記的核酸適配體 分子探針。 實(shí)現(xiàn)適配體在微納材料表面的高效 結(jié)合，為適配體仿生識(shí)別界面的建立 提供理論指導(dǎo)和有效方法。建立快 速、高效的磁性分離平臺(tái)，建立低豐 度蛋白的快速富集與檢測(cè)技術(shù)。 建立基于核酸適配體的蛋白標(biāo)志物 富集與鑒定方法。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 克隆與表征特異性識(shí)別肝癌、食道 癌相關(guān)蛋白及癌細(xì)胞的核酸適配體， 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與冗余序列的剪裁，進(jìn) 行識(shí)別機(jī)理的 研究；進(jìn)一步篩選針對(duì) 肝癌、食道癌組織和血清樣品的核酸 適配體。 進(jìn)一步發(fā)展以納米材料為依托的非 標(biāo)記核酸適配體傳感技術(shù)，以小分子 探針的集聚效應(yīng)等為基礎(chǔ)，發(fā)展基于 獲得 23 種特異性識(shí)別肝癌、食道癌 相關(guān)蛋白核酸適配體；獲得 34 種特 異性識(shí)別肝癌或食道癌細(xì)胞和組織 的核酸適配體。 利用核酸適配體與靶蛋白結(jié)合時(shí)的 構(gòu)象互變性質(zhì)，發(fā)展非標(biāo)記的蛋白質(zhì) 核酸適配體分析方法。利用熒光納米 顆粒等納米材料具有穩(wěn)定性好、信號(hào) 強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建核酸適配體熒光 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 系 列 DNA 或 RNA 文庫(kù)的合成；針 對(duì)肝癌、食道癌相關(guān)蛋白的核酸適配 體的初步篩選；肝癌食道癌細(xì)胞系、 組織樣品以及反篩選樣品的制備。針 對(duì)肝癌、食道癌細(xì)胞的核酸適配體初 步篩選。 以核酸適配體的 分子識(shí)別效應(yīng)與 構(gòu)象變化效應(yīng)為基礎(chǔ)，結(jié)合納米生物 技術(shù)，研究核酸適配體的非共價(jià)標(biāo)記 技術(shù)。探索基于各類集聚效應(yīng)的信號(hào) 傳導(dǎo)新技術(shù)。 開展適配體在微納分離材料表面 組裝性質(zhì)的研究，發(fā)展對(duì)應(yīng)的微納米 載體表面核酸適配體的固定技術(shù)，開 展適配體核酸堿基及分子結(jié)構(gòu)的改 造研究，系統(tǒng)研究多種固定載體與適 配體仿生界面制備的規(guī)律；開展磁性 微納顆粒分離技術(shù)和新型適配體負(fù) 載微納米粒子材料的研究。 發(fā)展通過細(xì)胞或組織篩選進(jìn)行高 通量的蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的新方法 設(shè)計(jì)與合成 5 個(gè) DNA 或 RNA 文 庫(kù)；初步富集到可識(shí) 別肝癌、食道癌 相關(guān)蛋白的核酸適配體庫(kù)一個(gè)；初步 富集到可識(shí)別肝癌、食道癌細(xì)胞的核 酸適配庫(kù) 2 個(gè)。 構(gòu)建基于非共價(jià)標(biāo)記的核酸適配體 分子探針。 實(shí)現(xiàn)適配體在微納材料表面的高效 結(jié)合，為適配體仿生識(shí)別界面的建立 提供理論指導(dǎo)和有效方法。建立快 速、高效的磁性分離平臺(tái)，建立低豐 度蛋白的快速富集與檢測(cè)技術(shù)。 建立基于核酸適配體的蛋白標(biāo)志物 富集與鑒定方法。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 克隆與表征特異性識(shí)別肝癌、食道 癌相關(guān)蛋白及癌細(xì)胞的核酸適配體， 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與冗余序列的剪裁，進(jìn) 行識(shí)別機(jī)理的 研究；進(jìn)一步篩選針對(duì) 肝癌、食道癌組織和血清樣品的核酸 適配體。 進(jìn)一步發(fā)展以納米材料為依托的非 標(biāo)記核酸適配體傳感技術(shù)，以小分子 探針的集聚效應(yīng)等為基礎(chǔ)，發(fā)展基于 獲得 23 種特異性識(shí)別肝癌、食道癌 相關(guān)蛋白核酸適配體；獲得 34 種特 異性識(shí)別肝癌或食道癌細(xì)胞和組織 的核酸適配體。 利用核酸適配體與靶蛋白結(jié)合時(shí)的 構(gòu)象互變性質(zhì)，發(fā)展非標(biāo)記的蛋白質(zhì) 核酸適配體分析方法。利用熒光納米 顆粒等納米材料具有穩(wěn)定性好、信號(hào) 強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建核酸適配體熒光 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 系 列 DNA 或 RNA 文庫(kù)的合成；針 對(duì)肝癌、食道癌相關(guān)蛋白的核酸適配 體的初步篩選；肝癌食道癌細(xì)胞系、 組織樣品以及反篩選樣品的制備。針 對(duì)肝癌、食道癌細(xì)胞的核酸適配體初 步篩選。 以核酸適配體的 分子識(shí)別效應(yīng)與 構(gòu)象變化效應(yīng)為基礎(chǔ)，結(jié)合納米生物 技術(shù)，研究核酸適配體的非共價(jià)標(biāo)記 技術(shù)。探索基于各類集聚效應(yīng)的信號(hào) 傳導(dǎo)新技術(shù)。 開展適配體在微納分離材料表面 組裝性質(zhì)的研究，發(fā)展對(duì)應(yīng)的微納米 載體表面核酸適配體的固定技術(shù)，開 展適配體核酸堿基及分子結(jié)構(gòu)的改 造研究，系統(tǒng)研究多種固定載體與適 配體仿生界面制備的規(guī)律；開展磁性 微納顆粒分離技術(shù)和新型適配體負(fù) 載微納米粒子材料的研究。 發(fā)展通過細(xì)胞或組織篩選進(jìn)行高 通量的蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的新方法 設(shè)計(jì)與合成 5 個(gè) DNA 或 RNA 文 庫(kù)；初步富集到可識(shí) 別肝癌、食道癌 相關(guān)蛋白的核酸適配體庫(kù)一個(gè)；初步 富集到可識(shí)別肝癌、食道癌細(xì)胞的核 酸適配庫(kù) 2 個(gè)。 構(gòu)建基于非共價(jià)標(biāo)記的核酸適配體 分子探針。 實(shí)現(xiàn)適配體在微納材料表面的高效 結(jié)合，為適配體仿生識(shí)別界面的建立 提供理論指導(dǎo)和有效方法。建立快 速、高效的磁性分離平臺(tái)，建立低豐 度蛋白的快速富集與檢測(cè)技術(shù)。 建立基于核酸適配體的蛋白標(biāo)志物 富集與鑒定方法。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 克隆與表征特異性識(shí)別肝癌、食道 癌相關(guān)蛋白及癌細(xì)胞的核酸適配體， 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與冗余序列的剪裁，進(jìn) 行識(shí)別機(jī)理的 研究；進(jìn)一步篩選針對(duì) 肝癌、食道癌組織和血清樣品的核酸 適配體。 進(jìn)一步發(fā)展以納米材料為依托的非 標(biāo)記核酸適配體傳感技術(shù)，以小分子