【正文】 篩選；肝癌食道癌細胞系、 組織樣品以及反篩選樣品的制備。 建立基于核酸適配體的蛋白標志物 富集與鑒定方法。 發(fā)展通過細胞或組織篩選進行高 通量的蛋白質標志物發(fā)現(xiàn)的新方法 設計與合成 5 個 DNA 或 RNA 文 庫；初步富集到可識 別肝癌、食道癌 相關蛋白的核酸適配體庫一個；初步 富集到可識別肝癌、食道癌細胞的核 酸適配庫 2 個。針 對肝癌、食道癌細胞的核酸適配體初 步篩選。 建立基于核酸適配體的蛋白標志物 富集與鑒定方法。 發(fā)展通過細胞或組織篩選進行高 通量的蛋白質標志物發(fā)現(xiàn)的新方法 設計與合成 5 個 DNA 或 RNA 文 庫；初步富集到可識 別肝癌、食道癌 相關蛋白的核酸適配體庫一個；初步 富集到可識別肝癌、食道癌細胞的核 酸適配庫 2 個。針 對肝癌、食道癌細胞的核酸適配體初 步篩選。將適用于分型診斷的核 酸適配體用于血清樣本的檢測，評估其在早期惡性腫瘤患者分型診斷中的意義。 2．蛋白質標志物的發(fā)現(xiàn)與驗證：通過與病變體系特征的蛋白質標志物對應 的核酸適配體分離與富集蛋白質標志物，并利用質譜與核磁譜技術鑒定相關的蛋 白標志物。優(yōu) 化流路尺寸、核酸適配體固定模式，研究流路 與流體控制對富集捕獲效率的影響， 實現(xiàn)低豐度蛋白質的高效率、自動化的富集，并開展癌癥早期診斷應用研究。研究微球表面的核酸適配體的修飾密 度，通過理論與實驗分析其理論容量。 4．基于核酸適配體的蛋白質傳感器技術：基于納米金、量子點、硅納米熒 光粒子，介孔納米材料、碳納米管和磁性納米粒子等，發(fā)展用于高靈敏生物傳感 的核酸適配體探針，基于核酸放大技術，發(fā)展微陣列檢測中基于光、電、磁信號 傳導與放大的新方法；研制高靈 敏的壓電、阻抗、可視、熒光及表面等離子共振 等無標記的蛋白質傳感器，通過傳感器綜合優(yōu)化，實現(xiàn)蛋白質的高通量、高靈敏、 高選擇性檢測，并開展癌癥早期診斷應用研究。 主要研究內容： 1．核酸適配體的功能化與分子探針的制備：研究不影響核酸 適配體特異性 的化學修飾、標記、與組裝方法，結合納米生物技術，制備靈敏、簡便、經(jīng)濟的 核酸適配體分子探針。通過分子模擬，建立核酸 適配體分子識別 的理論模型，指導核酸適配體分子探針的設計。 課題 1 核酸適配體篩選新方法的基礎研究 參加單位： 湖南大學， 中國科學院化學研究所 負責人：譚蔚泓教授 學術骨干：俞汝勤院士，方曉紅教授，蔣健暉教授，李繼山副教授 經(jīng)費比例： 28% 研究目標： 發(fā)展細胞、組織等不同多蛋白質復合靶標體系核酸適配體篩選方法，通過化 學合成、目標篩選、分子裁減、功能化衍生等手段，設計、合成并篩選具有獨特 優(yōu)良性能的核酸適配體；研究這類復合體系核酸適配體的分子識別圖譜；闡明核 酸適配體的分子識別基礎，為課題 2與 3中蛋白質定量檢測與分離新方法的研究提 供指導。課題 1 是其它 3 個課題的 基礎，為課題 2 和課題 3 的實施提供理論指導與研究工具，也為課題 4 中蛋白質 標志物發(fā)現(xiàn)提供新的技術依據(jù)和平臺；課題 2 和課題 3 在課題 1 的指導下，以課 題 4 涉及的目標為對象，建立高靈敏、高選擇性、高通量的蛋白質分離與檢測新 方法，提供技術平臺，并針對癌癥早期診斷這一應用出口進行驗證；課題 4 是課 題 3 研究的外延與主要應用 出口，主要開展蛋白質標志物發(fā)現(xiàn)的新方法與 癌癥早期診斷的核酸適配體分子識別圖譜方法研究，該課題反過來也為課題 3 的實施提供物質基礎。因此，研究技術路線先進可行，已經(jīng)具備了取得重大突破的條 件。另一方面，本項目提出將核酸適配體分子識別圖譜方法用于癌 癥早期診斷與分子分型，這一自主創(chuàng)新的關鍵技術可在對惡性腫瘤等重大疾病蛋 白質標志物、及腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不清楚的條件下，發(fā)展腫瘤特異性分 子探針組，進而探索疾病發(fā)生、發(fā)展過程中蛋白質標志物的分子指紋與表達、變 化模式，從而實現(xiàn)對應惡性腫瘤的個性化分子診斷與治療。 在基于核酸適配體的蛋白質標志物發(fā)現(xiàn)方法方面 : 主要承擔單位之一的中 國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所是長期從事惡性腫瘤的基礎與臨床研究的國 內優(yōu)勢單位 , 是一個醫(yī)療服務輻射全國的大型腫瘤?？漆t(yī)院，具有豐富的臨床資 源，擁有豐富的癌組織、血清、癌細胞系 儲備，已獲得了相關疾病的多個重要標 志物和蛋白質靶標，建立了靶向治療載體平臺技術與相關動物模型，成功研究了 多種抗腫瘤疫苗與藥物。這些工作為本項目針對 食管癌、肝癌樣品的核酸適配體篩選提供了理論與技術保障。 各參加單位在相關研究領域有長期的研究積累，而且已經(jīng)合作開展了與本項目相 關的前期研究工作 ,并取得具有國際影響的創(chuàng)新性成果。系統(tǒng)研究核酸適配體分子識別體系的識別規(guī) 律，建立核酸適配體篩選的統(tǒng)計理論與模型，在理論層次上指導基于核酸適配體 的蛋白質分離與檢測新技術與新方法的設計與應用。 本項目具有以下特色： （ 1）創(chuàng)新性強。這些新技術、新方法的發(fā)展， 可望形成性能優(yōu)良的蛋白質分離與富集技術平臺。 蛋白質定量檢測新方法方面：利用核酸適配體易于修飾與標記的特性， 將核酸適配體轉化為人工設計的多功能化生物分子探針。通過質譜技術和蛋白質序列比對、結構功能預 測以及樹狀分類分析等生物信息學手段分析與核酸適配體結合的蛋白質的結構 和功能，研究腫瘤 發(fā)生發(fā)展的機理。 （ 6）惡性腫瘤等重大疾病早期診斷方法與發(fā)生發(fā)展分子機制研究： 利用項目所篩選的肝癌、食管癌核酸適配體，通過對大量早期腫瘤患者、健 康對照人群進行血清樣本檢測，探討核酸適配體作為惡性腫瘤早期診斷指標的價 值。對于充分 驗證的特異性核酸適配體，將其修飾于微流控芯片或微珠表面，并連續(xù)與癌細胞 或組織裂解產(chǎn)物進行溫育以捕獲對應的蛋白質標志物。建立用于蛋白質分離與富集的微流控芯片技術，通過 光刻法制備 PDMS微流控芯片，通過在芯片上固定的核酸適配體與樣品混合物的 循環(huán)流動進行低豐度蛋白質的富集捕獲。在此基礎上，研制壓電、阻抗、表面等離子共振等無標記型高 靈敏、高通量、高精度蛋白質定量檢測新方法。結合納米生物技術和核酸適配體分子識別特性，制備多種靈敏、簡便、經(jīng) 濟的核酸適配體分子探針，考察探針對靶分子或靶細胞的識別能力，研究其相互 作用的動力學過程，發(fā)展改善探針靶向識別性能的方法，并建立納米探針凝集等 蛋白質定量檢測新原理。通過化學 計算、分子模擬和分子設計，進行適配體與靶分子對接分析與自適應識別研究， 建立相關理論模型，并利用這些模型和機制評估、設計新的核酸適配體分子探針， 為建立基于核酸適配體的蛋白質研究新方法提 供理論依據(jù)與指導。 對于已知的幾種肝癌和食道癌相關蛋白質（如 AFP、 PIVKAII、 P53 Ab），采用體 外表達純化的蛋白質直接進行篩選，通過系統(tǒng)優(yōu)化篩選壓力，獲得特異性高和親 和力強的核酸適配體；同時為了發(fā)現(xiàn)未知蛋白質標志物，以肝癌和食道癌細胞、 癌組織作為正篩選靶標，甄別對應非癌細胞系、癌旁組織等做陰性對照進行反向 篩選，優(yōu)化篩選條件與流程。 （ 2）通過學科交叉，發(fā)展癌癥早期診治新方法 隨著核酸適配體、納米生物探針、蛋白質組學研究方法的發(fā)展和成熟 , 核酸 適配體技術在惡性腫瘤等重大疾病診治方面的應用正面臨新的機遇。申請并獲得一批具有 產(chǎn)業(yè)化前景的發(fā)明專利。 3. 發(fā)展高靈敏、高通量、高準確度的蛋白質定量檢測的新原理、新方法， 提出高效率、高重現(xiàn)性的蛋白質分離富集的新方法、新技術，研制出相應高通量、 自動化的蛋白質分離及檢測系統(tǒng)，對低豐度蛋白檢測的靈敏度達到 1 pg/mL及更 低水平，為腫瘤的蛋白質生物標志物的發(fā)現(xiàn)、重大疾病的分子機制研究與早期診 斷提供研究工具。 項目名稱： 基于核酸適配體的蛋白質研究新技術和新方法 首席科學家： 譚蔚泓 湖南大學 起止年限： 至 依托部門： 教育部 二、預期目標 總體目標 : 本項目針對當前蛋白質研究中存在的瓶頸問題，發(fā)展基于核酸適配體的蛋白 質研究新技術新方法；以肝癌和食管癌為研究對象，面向我國社會發(fā)展中提高人 類健康的重大需求，通過建立肝癌和食管癌相關蛋白的發(fā)現(xiàn)、分離分析、檢測表 征等新技術，探索肝癌和食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機制 ，為惡性腫瘤等重大疾病早 期診斷提供新技術和新方法。 2． 揭示核酸適配體與蛋白質相互作用的分子機制，發(fā)展 24種具有自主知識 產(chǎn)權的系統(tǒng)研究核酸適配體分子識別的方法，為核酸適配體分子探針的設計、篩 選、構 /效關系和性能評價提供理論指導。發(fā)表一批高水平、具有重要國際影響的學術論文。 三、研究方案 （一）總體思路 （ 1）以腫瘤為研究模型，發(fā)展基于核酸適配體的蛋白質研究技術 本項目從 “國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要 ”中 “人口與健康 ”等國家重 大戰(zhàn)略需求出發(fā)，以 2020年度起蛋白質研究重大計劃重要支持方向 “蛋白質研究 的新技術和新方法 ” ——“核酸適配體識別等新技術新方法 ”為依據(jù)，發(fā)揮核酸適 配體所具備的高特異性、高親和力、高穩(wěn)定性、便于化學修飾與功能化、易于大 量低成本與可重復性合成等優(yōu)勢，以及 可通過核酸適配體篩選發(fā)現(xiàn)未知蛋白標志 物并獲得病變體系特征分子圖譜的優(yōu)越性，開展核酸適配體分子識別基礎研究， 指導蛋白質分離與檢測方法的設計與發(fā)展，建立高通量、高靈敏、高準確度的蛋 白質研究新方法和新技術，為癌癥早期診斷提供特異性蛋白質標志物、分子探針、 分子識別傳感器件，滿足提升我國人民健康水平的需求。優(yōu)化篩選條件與流程。 （ 2）核酸適配體分子識別基礎的研究： 利用光譜技術、質譜技術、多維核磁共振和單分子探針技術揭示核酸適配體 與靶蛋白質分子相互作用的構 /效關系，深入研究生物分子識別規(guī)律。 （ 3）基于核酸適配體的蛋白質定量檢測方法研究： 基于上述篩選出來針對 特定蛋白質分子的核酸適配體及其分子識別特性，設 計構象互變型與鏈置換型熒光分子探針，發(fā)展均相、高通量的蛋白質定量檢測新 方法。探討傳感界面體系探針分子 的負載量與仿生分子識別能力的關系，探索提高仿生分子識別體系納米傳感器、 微傳感器、微陣列和微芯片系統(tǒng)的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性的方法，抑制復雜生物體系中 的交叉干擾現(xiàn)象。對于樣品中高豐度 蛋白質的去除，也將考察二氧化硅分離基質的制備，進一步提高高豐度蛋白質去 除的容量與操作的簡便 性。通過考察核酸適配體對大量食管癌、肝癌的細胞、組織 及血清識別行為，系統(tǒng)評價所獲得的核酸適配體對惡性腫瘤的特異性。此外，以核 酸適配體探針結合分子成像與流式細胞分析技術，研究相關標志物在病變體系的 分布、定位、及動態(tài)變化情況，進行標志物的直觀量化評估。 利用生物探針和納米生物傳感器，開發(fā)基于液相芯片系統(tǒng)和金標 膜載體配合的 核酸適配體快速診斷試劑和設備。這些新篩選方法將成為疾 病診斷、分子機制研究與疾病標志物發(fā)現(xiàn)、鑒定的新的重要資源。 蛋白質分離新技術、新方法方面：針對翻譯后修飾蛋白質難以選擇性富 集的難題，提出以糖基化、磷酸化、泛素化這類免疫原性很小的蛋白質翻譯后修 飾基團為靶標篩選核酸適配體，以分離富集相關修飾蛋白；利用核酸適配體可規(guī) ?；瘜W合成、批間誤差小、成本低、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，發(fā)展具有高容量、高精 度 的低豐度蛋白富集技術與高豐度蛋白的去除技術。通過創(chuàng)新性地結合納米生 物技術與核酸適配體分子工程技術，獲得一系列高靈敏、實時的生物檢測新方法 與新器件，將為表達差異小、低豐度生物靶標的鑒定與研究提供關鍵的檢測技術 與方法，可望在重大疾病的早期診斷方法學與技術基礎方面取得創(chuàng)新性成果。 （ 2）突出理論與應用的交叉。 （四）可行性 本項目根據(jù)設定的研究目標和內容，凝聚了一支來自國內主要優(yōu)勢單位的多 學科緊密配合的創(chuàng)新研究團隊，共有 8個不同學科的國家重點實驗室或部門重點 實驗室參與研究工作，研究條件互補性強，具備了開展本項研究的軟硬件條件。中國醫(yī)學科 學院開展了對腫瘤組織樣本的核酸適配體篩選初步工作 。中科院長春應用化學所、 南京大學在核酸與蛋白界面組裝、納米技術、電化學、微電極系統(tǒng)方面