環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌新型試劑盒研制可行性研究報(bào)告(編輯修改稿)
2024-10-01 09:57 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 模板濃度、 dNTP 濃度、BstDNA 聚合酶用量、 Mg2+濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠獲得最佳實(shí)驗(yàn)條件。 創(chuàng)新點(diǎn) （ 1）既往對(duì)病原菌的檢測(cè)一般采用細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定法，但該方法的準(zhǔn)確率低，所需時(shí)間長(zhǎng)，往往延誤臨床正確的診斷和治療。近年來(lái)，人們將 PCR技術(shù)用于病原菌的檢測(cè)。 PCR 技術(shù)雖然較傳統(tǒng)方法靈敏、快速，但需要較昂貴的儀器設(shè)備。更為重要的是， PCR 方法容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，影響對(duì)樣品的 冊(cè)律師辦理 建設(shè)工程法律業(yè)務(wù)操作指引之盡職調(diào)查 .第一章…………………… 3第二章………………………… 9(可行性研究報(bào)告項(xiàng)目建議書營(yíng)銷策劃商業(yè)策劃書組織設(shè)計(jì)公務(wù)員考試可行性分析報(bào)告環(huán)境影響報(bào)告書 正確判斷。 本項(xiàng)目將建立適合于食品和臨床標(biāo)本大規(guī)模檢測(cè)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌技術(shù)。與目前的檢測(cè)方法相比，等溫?cái)U(kuò)增法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。而且，等溫?cái)U(kuò)增法是在恒溫下進(jìn)行，只需一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫裝置，不需要 PCR實(shí)驗(yàn)中的昂貴儀器，因而易于在基層食品質(zhì)量檢測(cè)部門和醫(yī)院推廣使用。 （ 2）目前，國(guó)外已有將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于病毒 DNA 和RNA檢測(cè)的報(bào)道，但將其應(yīng)用于病原菌檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道極少，國(guó)內(nèi)基本上還未開展環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增研究工作。本項(xiàng)目首次提出將環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于食品和臨床標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)，并對(duì)目前的等溫?cái)U(kuò)增方法提出改進(jìn)策略，發(fā)展可同時(shí)檢測(cè)多種病原菌的多重等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，以克服當(dāng)前一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)只能檢測(cè)一種 DNA或 RNA的缺點(diǎn)。因此，本項(xiàng)目的實(shí)施，將開發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的病原菌檢測(cè)試劑盒。 項(xiàng)目完成時(shí)達(dá)到的技術(shù)水平 項(xiàng)目完成時(shí)，開發(fā)的多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌技術(shù)及其配套試劑盒達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。 （二）項(xiàng)目技術(shù)方案 技術(shù)方案 （ 1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（ LAMP）和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)常見病原菌方法的建立 ①常見病原菌特異性 LAMP 引物的設(shè)計(jì)。根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)公布的常見病原菌 DNA 序列，采用 LAMP 專用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性 冊(cè)律師辦理 建設(shè)工程法律業(yè)務(wù)操作指引之盡職調(diào)查 .第一章…………………… 3第二章………………………… 9(可行性研究報(bào)告項(xiàng)目建議書營(yíng)銷策劃商業(yè)策劃書組織設(shè)計(jì)公務(wù)員考試可行性分析報(bào)告環(huán)境影響報(bào)告書 LAMP 引物（包括每類致病菌的兩個(gè)外引物、兩個(gè)內(nèi)引物和兩個(gè)環(huán)引物，其中每個(gè)內(nèi)引物均具有兩段能夠識(shí)別靶分子上特定位點(diǎn)的序列，以保證靶序列的特異性擴(kuò)增。） ②常見病原菌基因組 DNA 的提取。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的基因組DNA 快速提取技術(shù)提取致病菌 DNA。 ③ LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化：對(duì)引物濃度、內(nèi)引物和外引物的最佳濃度比、模板濃度、 dNTP 濃度、 BstDNA 聚合酶用量、 Mg2+濃度等條件進(jìn) 行優(yōu)化。 ④溫育條件的優(yōu)化：在 5565℃之間優(yōu)化等溫?cái)U(kuò)增溫度。 ⑤擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：建立快速顯色法和電泳分析法兩種檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。 ⑥以上述研究結(jié)果為基礎(chǔ)，建立常見病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)。 （ 2）常見病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的靈敏度分析 將常見病原菌目標(biāo)基因克隆至 pMD18T載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，倍比稀釋成含目的基因拷貝數(shù)為 10 10 10 10 101，以其為模板做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)本方法的靈敏度。 （ 3）常見病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法 的特異性分析 分別以病原菌和非病原菌基因組 DNA 為模板做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)本方法的特異性。 （ 4）常見病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法及常規(guī) PCR 擴(kuò)增方法比較分析 冊(cè)律師辦理 建設(shè)工程法律業(yè)務(wù)操作指引之盡職調(diào)查 .第一章…………………… 3第二章………………………… 9(可行性研究報(bào)告項(xiàng)目建議書營(yíng)銷策劃商業(yè)策劃書組織設(shè)計(jì)公務(wù)員考試可行性分析報(bào)告環(huán)境影響報(bào)告書 以 LAMP 的兩個(gè)外引物做常規(guī) PCR 擴(kuò)增，并與 LAMP 的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較分析，進(jìn)一步判斷 LAMP 技術(shù)的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。 （ 5）常見病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法在食品檢測(cè)和臨床診斷中的應(yīng)用研究 將本方法應(yīng)用于食品檢測(cè)和臨床診斷中，分析本方法對(duì)不同樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確率。 （ 6）病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
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