pcr常見問題總匯(編輯修改稿)
2024-09-26 06:40 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 鋪板 DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用 10ng DNA，用 SOC 稀釋到 1000u后含 10 ng DNA，用 1/10 鋪板，共用 1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為： 1000 克隆 X10（ 3 次方） ng /鋪板 1 ng DNA ug=10（ 6 次方） cfu/ ug 轉(zhuǎn)化 pGEMT 應(yīng)用 10（ 8 次方） cfu/ ug 感受態(tài)細胞 如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低。 C）如用 pGEMT 正對照，或 PCR 產(chǎn)物，產(chǎn)生 2040 藍斑（用指定步驟 10（ 8 次方） cfu/ ug 感受態(tài)細胞），表明載體失去 T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。 T4 DNA連接酶（ M1801， M1804， M1794）質(zhì)量標準好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的 T4 DNA連接酶替換。 D）用 pGEMT 或 pGEMT Easy 載體，連接 pGEMT 正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細胞（ 10（ 8 次方） cfu/ug） ,按照指定的實驗步驟，可得 100 個菌落，其中 60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生 2040 藍斑 , 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。 4)對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？ A）連接用室溫保溫 1 小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需 4℃ 過夜。 B）插入片段帶有污染，使 3`T 缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和 pGEMT 正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸 酶，使 pGEMT 或 pGEMT Easy 載體 3`T 缺失。 C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受 UV 過度照射，時有發(fā)生。 UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接， DNA必需重新純化。 D）帶有修復(fù)功能的耐熱 DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無 A，后者是 pGEMT 或 pGEMT Easy 載體克隆所需。加 Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加 A。詳情查 pGEMT pGEMT Easy 載體技術(shù)資料（ TM042）。 E）高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和 重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如 SURE 細胞 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標準的 PCR 反應(yīng)體系： 10擴增緩沖液 10ul 4 種 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加雙或三蒸水至 100ul PCR 反應(yīng)五要素： 參加 PCR 反應(yīng) 的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵， PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段
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