【正文】 tca cctgggtctg 1861 cacgcccttt ctggtggcct tgtgcacatt tgccgtctac gtgaccattg acgagaacaa 1921 catcctggat gcccagacag ccttcgtgtc tttggccttg ttcaacatcc tccggtttcc 1981 cctgaacatt ctccccatgg tcatcagcag catcgtgcag gcgagtgtct ccctcaaacg 2041 cctgaggatc tttctctccc atgaggagct ggaacctgac agcatcgagc gacggcctgt 2101 caaagacggc gggggcacga acagcatcac cgtgaggaat gccacattca cctgggccag 2161 gagcgaccct cccacactga atggcatcac cttctccatc cccgaaggtg ctttggtggc 2221 cgtggtgggc caggtgggct gcggaaagtc gtccctgctc tcagccctct tggctgagat 2281 ggacaaagtg gaggggcacg tggctatcaa gggctccgtg gcctatgtgc cacagcaggc 2341 ctggattcag aatgattctc tccgagaaaa catccttttt ggatgtcagc tggaggaacc 2401 atattacagg tccgtgatac aggcctgtgc cctcctccca gacctggaaa tcctgcccag 2461 tggggatcgg acagagattg gcgagaaggg cgtgaacctg tctgggggcc agaagcagcg 2521 cgtgagcctg gcccgggccg tgtactccaa cgctgacatt tacctcttcg atgatcccct 2581 ctcagcagtg gatgcccatg tgggaaaaca catctttgaa aatgtgattg gccccaaggg 2641 gatgctgaag aacaagacgc ggatcttggt cacgcacagc atgagctact tgccgcaggt 2701 ggacgtcatc atcgtcatga gtggcggcaa gatctctgag atgggctcct accaggagct 2761 gctggctcga gacggcgcct tcgctgagtt cctgcgtacc tatgccagca cagagcagga 2821 gcaggatgca gaggagaacg gggtcacggg cgtcagcggt ccagggaagg aagcaaagca 2881 aatggagaat ggcatgctgg tgacggacag tgcagggaag caactgcaga gacagctcag 2941 cagctcctcc tcctatagtg gggacatcag caggcaccac aacagcaccg cagaactgca 3001 gaaagctgag gccaagaagg aggagacctg gaagctgatg gaggctgaca aggcgcagac 3061 agggcaggtc aagctttccg tgtactggga ctacatgaag gccatcggac tcttcatctc 3121 cttcctcagc atcttccttt tcatgtgtaa ccatgtgtcc gcgctggctt ccaactattg 3181 gctcagcctc tggactgatg accccatcgt caacgggact caggagcaca cgaaatagtccg 3241 gctgagcgtc tatggagccc tgggcatttc acaagggatc gccgtgtttg gctactcc 3301 ggccgtgtcc atcgggggga tcttggcttc ccgctgtctg cacgtggacc tgctgcacag 3361 catcctgcgg tcacccatga gcttctttga gcggaccccc agtgggaacc tggtgaaccg 3421 cttctccaag gagctggaca cagtggactc catgatcccg gaggtcatca agatgttcat 3481 gggctccctg ttcaacgtca ttggtgcctg catcgttatc ctgctggcca cgcccatcgc 3541 cgccatcatc atcccgcccc ttggcctcat ctacttcttc gtccagaggt tctacgtggc 3601 ttcctcccgg cagctgaagc gcctcgagtc ggtcagccgc tccccggtct attcccattt 3661 caacgagacc ttgctggggg tcagcgtcat tcgagccttc gaggagcagg agcgcttcat 3721 ccaccagagt gacctgaagg tggacgagaa ccagaaggcc tattacccca gcatcgtggc 3781 caacaggtgg ctggccgtgc ggctggagtg tgtgggcaac tgcatcgttc tgtttgctgc 3841 cctgtttgcg gtgatctcca ggcacagcct cagtgctggc ttggtgggcc tctcagtgtc 3901 ttactcattg caggtcacca cgtacttgaa ctggctggtt cggatgtcat ctgaaatgga 3961 aaccaacatc gtggccgtgg agaggctcaa ggagtattca gagactgaga aggaggcgcc 4021 ctggcaaatc caggagacag ctccgcccag cagctggccc caggtgggcc gagtggaatt 4081 ccggaactac tgcctgcgct accgagagga cctggacttc gttctcaggc acatcaatgt 4141 cacgatcaat gggggagaaa aggtcggcat cgtggggcgg acgggagctg ggaagtcgtc 4201 cctgaccctg ggcttatttc ggatcaacga gtctgccgaa ggagagatca tcatcgatgg 齊齊哈爾大學畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 15 4261 catcaacatc gccaagatcg gcctgcacga cctccgcttc aagatcacca tcatccccca 4321 ggaccctgtt ttgttttcgg gttccctccg aatgaacctg gacccattca gccagtactc 4381 ggatgaagaa gtctggacgt ccctggagct ggcccacctg aaggacttcg tgtcagccct 4441 tcctgacaag ctagaccatg aatgtgcaga aggcggggag aacctcagtg tcgggcagcg 4501 ccagcttgtg tgcctagccc gggccctgct gaggaagacg aagatccttg tgttggatga 4561 ggccacggca gccgtggacc tggaaacgga cgacctcatc cagtccacca tccggacaca 4621 gttcgaggac tgcaccgtcc tcaccatcgc ccaccggctc aacaccatca tggactacac 4681 aagggtgatc gtcttggaca aaggagaaat ccaggagtac ggcgccccat cggacctcct 4741 gcagcagaga ggtcttttct acagcatggc caaagacgcc ggcttggtgt gagccccaga 4801 gctggcatat ctggtcagaa ctgcagggcc tatatgccag cgcccaggga ggagtcagta 4861 cccctggtaa accaagcctc ccacactgaa accaaaacat aaaaaccaaa cccagacaac 4921 caaaacatat tcaaagcagc agccaccgcc atccggtccc ctgcctggaa ctggctgtga 4981 agacccagga gagacagaga tgcgaaccac c 根據(jù) 2 個靶序列設(shè)計的 2 對 DNA 干涉片段 mrp11， mrp12 序列見表 ； ： 表 根據(jù)靶位點合成的干涉片段 1（ mrp11） 序列 Table siRNA sequence synthesized according to target 1point 1 Mrp1 靶序列 1 aattctcaatgggatcaaagt 正義鏈（ 2sense） 5′GATCCaattctcaatgggatcaaagtTTCAAGAGAactttgatcccattgagaattTTTTTTGGAAA3′ 反義鏈（ 2antisense） 5′AGCTTTTCCAAAAAAaattctcaatgggatcaaagtTCTCTTGAAactttgatcccattgagaattG3′ 表 根據(jù)靶位點合成的干涉片段 2（ mrp12） 序列 Table siRNA sequence synthesized according to target 1point 2 Mrp1 靶序列 2 ggatcaagaccgctgtcat 正義鏈（ 3sense） 5′GATCCggatcaagaccgctgtcatTTCAAGAGAatgacagcggtcttgatccTTTTTTGGAAA3′ 反義鏈（ 3antisense） 5′AGCTTTTCCAAAAAAggatcaagaccgctgtcatTCTCTTGAAatgacagcggtcttgatccG3′ 齊齊哈爾大學畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 16 合成干涉片段的退火 合成片段的退火體系： 干涉片段 1 干涉片段 2 sense 2 μL 2 μL antisense 2 μL 2 μL 10PCR buffer 5 μL 5 μL dd H2O 41 μL 41 μL 各 管 混勻后 90℃ 保溫 3 分鐘， 37℃ 保溫 1h，再取 5μL 退火溶液加 45μL 滅菌雙蒸水混勻，使干涉片段終濃度為 8ng/μL。 （ 8）加 倍體積 （約 54ml） 的異丙醇，充分混勻，室溫放置 15min，以沉淀核酸。 （ 17） 小心吸上清與另一離心管中，加 2 倍體積的預冷無水乙醇，再加 體積的NaAC（ 3mol ， ）以除去酚，冰上沉淀 20min， 4℃ 下 10000r/min 離心 15min，使DNA 沉淀出來。 （ 8） 9000g/分離心 1 分鐘，管底溶液即為雙酶切后質(zhì)粒載體。 （ 4） 向 各 管中加入 1mL LB 液體培養(yǎng)基（不含 Amp），混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1h，保證恢復 細菌正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（ Amp）。 1 2 3 圖 34 膠回收質(zhì)粒 片段 1kb marker 質(zhì)粒經(jīng) Hind Ⅲ 單酶切產(chǎn)物 回收的雙切產(chǎn)物 Recovery products of linear plasmid 1kb marker Ⅲ Recovery products of plasmid digested by double enzymes 6000bp 齊齊哈爾大學畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 24 重組載體的菌落 PCR 重組載體菌落 PCR 電泳結(jié)果見圖 35，結(jié)果顯示 PCR 擴增產(chǎn)物 ,電泳分析發(fā)現(xiàn)陽性產(chǎn)物可以擴增出 560bp 大小的條帶，假陽性產(chǎn)物不能擴增出 560bp 大小的條帶 ,與預期結(jié)果相符，可以初步篩選出陽性產(chǎn)物。 （ 9）分裝細 胞，每 200μL 一份，此細胞為感受態(tài)細胞。 齊齊哈爾大學畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 19 （ 4）重復步驟 4。 （ 14）加等體積含 13％（ w/v）聚乙二醇（ PEG 8000）的 ,充分混合， 齊齊哈爾大學畢業(yè)設(shè)計 (論文 ) 18 用微量離心機于 4℃ 以 120xx 轉(zhuǎn) /分，離心 15 分鐘，以回收質(zhì)粒 DNA。緩慢顛倒數(shù)次，防止破壞基因組 DNA，室溫放置 3min。 (6) 70%乙醇：取 300mL 無水乙醇溶于 700mL 水中。 3．質(zhì)粒 載體 經(jīng) Hind Ⅲ 和 BamH I 雙酶切，并進行膠回收 。 直到 1998 年， Andrew Fire 等證實 Guo 等發(fā)現(xiàn)的正義 RNA抑制同源基因表達的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的 RNA 中污染了微量 dsRNA 而引發(fā)， Andrew Fire 和 Craig Mello 將這一現(xiàn)象命