【正文】 大鼠取一個(gè)樣品；對于小鼠用衛(wèi)星動(dòng)物組 收集和分析對照組的樣品 期望有獨(dú)立的毒代動(dòng)力學(xué)報(bào)告 毒代動(dòng)力學(xué) 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 醫(yī)藥品通常不進(jìn)行臨床病理的檢驗(yàn)，除非有項(xiàng)目特殊要求（ STP, in press 2023） 實(shí)驗(yàn)終期進(jìn)行臨床病理檢測沒有價(jià)值，而中期處死時(shí)進(jìn)行卻很有價(jià)值 如果在實(shí)驗(yàn)早期沒有將臨床病理檢查定義好，在 15個(gè)月內(nèi)也可以考慮進(jìn)行特定的檢查 血涂片和骨髓涂片是否要進(jìn)行常規(guī)采集？ 可以作為保險(xiǎn)措施 通常不進(jìn)行 根據(jù)情況而定 臨床病理學(xué) 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 在全面評(píng)價(jià)潛在致癌性研究時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)是一個(gè)重要的工具 控制假陽性錯(cuò)誤 對罕見腫瘤 P 對常見腫瘤 P 專題負(fù)責(zé)人必須監(jiān)測活體階段所有初步假設(shè)的統(tǒng)計(jì)因素，并減少偏離 對死亡率、腫塊、大體和組織病理學(xué)數(shù)據(jù)的評(píng)估是十分復(fù)雜的 * 來自活體階段人員以及病理專家的數(shù)據(jù)要準(zhǔn)確完整 足夠的死亡率（到 80~90周時(shí)尚有 50%） 早期處死瀕死動(dòng)物以保存組織 跟蹤活體階段表明腫瘤 確定可能的死亡原因 *見指導(dǎo)原則 《 藥物慢性嚙齒類致癌試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，分析和闡釋中的統(tǒng)計(jì)學(xué) 》 , FDA CDER, 2023 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)考慮的因素 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 每層架子上的各組動(dòng)物數(shù)目相等 定期在房間內(nèi)交替架子，以減少視網(wǎng)膜退變 在非工作時(shí)間，采用低光照以減少視網(wǎng)膜退變 給藥順序：對照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組； 避免交叉污染 以同樣順序來采集毒代樣品 高標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物管理是至關(guān)重要的 保持同樣的飼料 /墊料來源，密切監(jiān)測成分 /污染物的變化 活體期間動(dòng)物的飼養(yǎng)與管理 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 如果死亡率很高，可能一個(gè)劑量組全部早期處死更合適 FDA在通訊中提到： 在第 100周以前，幸存動(dòng)物數(shù)降至 15時(shí)，可考慮處死該給藥組或該性別所 有動(dòng)物 在某些方案中，當(dāng)幸存動(dòng)物數(shù)降至 20時(shí)，停止對高劑量組該性別動(dòng)物的 給藥；當(dāng)幸存動(dòng)物降至 15時(shí)，處死高劑量組受影響的性別的所有動(dòng)物 如果對照組的幸存動(dòng)物數(shù)下降至 20或更少時(shí)，處死所有劑量組中受影響 的性別的所有動(dòng)物 在 100周以后，如果高劑量組的幸存動(dòng)物降至 15時(shí)，處死所有劑量組中受 影響的性別的所有動(dòng)物 早期處死一個(gè)劑量組不會(huì)實(shí)驗(yàn)無效 劑量組的提前終止 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 早期處死與早期死亡 所有組織采集 早期處死動(dòng)物比發(fā)現(xiàn)死亡動(dòng)物更有價(jià)值 大鼠品系的選擇會(huì)影響動(dòng)物的壽命和到計(jì)劃處死時(shí)存活的比例 Wistar大鼠存活率比 SD大鼠高 腫塊跟蹤 跟蹤活體階段的每一個(gè)腫塊 與解剖結(jié)果的關(guān)聯(lián) 通過顯微評(píng)價(jià)來跟蹤解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的腫塊（ Peto試驗(yàn)要求） 解剖 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 檢查方案中各組所有動(dòng)物的所有組織和腫塊 跟蹤解剖中發(fā)現(xiàn)的所有腫塊的顯微診斷 盡可能將大體觀察與顯微觀察結(jié)果關(guān)聯(lián)起來；但是 “大體觀察與顯微觀察沒有關(guān)聯(lián)” 也是可接受的，不是每個(gè)大體觀察都有相關(guān)聯(lián)的顯微觀察，重要的是你所觀察到的。 大鼠 因?yàn)?SD大鼠的死亡率高，所以每組動(dòng)物數(shù)量要多（ 70只 /性別 /組） Wistar和 F344大鼠存活率高些，但 F344漸漸不受歡迎 Wistar大鼠用的越來越多， 50只 /性別 /組 小鼠 CD1和 B3C6F1在兩年致癌性試驗(yàn)中較常用 種屬和品系的選擇 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 1個(gè)溶劑對照組， 3個(gè)給藥組 至少 50只 /性別 /組，可考慮增加（如： 70只 /性別 /組） 中期處死 毒代樣品采集 其他血樣采集 兩年存活率低 （終身試驗(yàn)）計(jì)劃給藥 104周 理想情況下，在計(jì)劃處死時(shí)能有 25只 /性別 /組 以計(jì)劃用于臨床的給藥方式給藥；環(huán)境化學(xué)品、人用食品添加劑或動(dòng) 物飼料補(bǔ)充劑等加入飲食中。在微孔中生長的抗性突變細(xì)胞集落呈 Poisson分布，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計(jì)算接種效率（ plating efficiency， PE）和突變率等指標(biāo)。 ICH S2(R1) Pfuhler S. et al. 2023 藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則 1 遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究 2 藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要 3 傳統(tǒng)和替代致癌試驗(yàn)的研究 4 4 主要內(nèi)容 遺傳毒性傳統(tǒng)試驗(yàn)方法 3 1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)（ Ames試驗(yàn)） 人工誘變的突變株在組 /色氨酸操縱子中有一個(gè)突變，突變的菌株必須依賴外源性組 /色氨酸才能生長，而在無組 /色氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活，致突變物可使其基因發(fā)生回復(fù)突變，使它在缺乏組 /色氨酸的培養(yǎng)基上也能生長。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 基本方法 ? 軟瓊脂平皿法（ soft agar method）在美國使用較多。 piga突變導(dǎo)致細(xì)胞表面 GPI錨蛋白缺陷。因而， FDA認(rèn)為該模型僅適宜評(píng)價(jià)遺傳毒性的化合物。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 試驗(yàn)結(jié)果的判定 ? 各處理組的 MF值呈 濃度依賴性升高 ，判定為陽性； ? MF值 ≥陰性對照值 +126， 判定為陽性。 3 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 遺傳毒性傳統(tǒng)試驗(yàn)方法 Thymidine Kinase (TK): 233 amino acids Coded by the autosomal tk gene tk gene: Situated at the distal end of the qarm of chromosome 11 (mouse) or chromosome 17 (human) Size of tk gene: 11 kb with 5 introns tk locus mutation: tk+ tk allele caused by T G transversion at position 489 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 基本原理 Target cell： Mouse lymphoma L5178Y tk +/ cell line ( . Mutat Res, 1977 ) L5178Y3 cell line （ tk +/+ ） EMS treatment cell line （ tk +/ ） cell line （ tk / ） Spontaneous reverse mutation (selected by THMG medium) MLA 基本原理 TK +/ cells (TFT sensitive THMG resistant) TK / cells (TFT resistant THMG sensitive) Mutagen treatment TK +/ cells (L5178Y, TK6, WTK1) treated by chemicals, and then selected by TFT (trifluorothymidine)