【正文】 4）裝板：裝板順序：黑板→海綿→三層濾紙→膠→PVDF膜→三層濾紙→海綿→白板。（7） 待其風(fēng)干后用剪刀沿染液邊緣剪下放入2ml試管中,%，放入55度氣浴鍋中煮1h。（處理葉片及取葉片過程中必須戴手套操作且鑷子需經(jīng)過嚴(yán)格消毒） 取處理過的低溫避光保存的葉片放入20度預(yù)冷的陶瓷研缽中加入液氮沿一個(gè)方向快速研磨，待其研磨成粉末狀時(shí)加入蛋白提取液繼續(xù)研磨一定時(shí)間后，吸取沉淀裝入2ml試管中，然后放入95度氣浴鍋中高溫加速提取蛋白10min。[6]橡膠的割膠也是一種機(jī)械傷害，因此，橡膠割膠后會(huì)產(chǎn)生大量的傷害乙烯，增加了依稀的釋放量。經(jīng)常被認(rèn)為是擴(kuò)大種植才引種到其他地方的，但是，病害也是其中很重要的原因。在巴西橡膠研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)樹干的機(jī)械損傷會(huì)對(duì)其乙烯途徑產(chǎn)生影響，而乙烯的排放量對(duì)排膠量有一定的影響，因此我們探究對(duì)葉片的損傷是否和對(duì)樹干損傷一樣對(duì)其乙烯途徑產(chǎn)生影響。按照全國(guó)天然橡膠優(yōu)勢(shì)區(qū)域布局規(guī)劃，科學(xué)合理地開展植膠生產(chǎn)，不斷鞏固現(xiàn)有產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)。l ddH2O TEMED 7181。BCA 法標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度設(shè)置在20～ 1 000 μg/mL 時(shí)r 。用來轉(zhuǎn)膜雜交的凝膠從左到右第9孔中分別用移液槍加入10μg處理時(shí)間為0、124h的樣品至孔底部，另一塊染色觀察的膠從左到右第28孔分別上樣10μg處理時(shí)間為0、1224小時(shí)葉片蛋白樣品。 ②將膜放入1 TBS中漂洗，除去固定交聯(lián)劑，5min/次，2次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)表明Esen method的重復(fù)性好，兩次實(shí)驗(yàn)得出的蛋白濃度比較接近，而另兩種方法兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差異較大，說明Esen method在定植物蛋白濃度時(shí)比BCA法和Bradford法精確。此外，我要特別感謝黃惜教授和生物技術(shù)研究所的各位老師長(zhǎng)期以來對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)環(huán)節(jié)的耐心指導(dǎo)和熱心幫助。最后觀察顯色后的PVDH膜。 （5）轉(zhuǎn)膜與驗(yàn)證：將組裝好的轉(zhuǎn)移槽放入冰盒的冰上，電流調(diào)到70mA左右開始轉(zhuǎn)膜。 （SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳 按照試劑配方配置10%分離膠7ml，按電泳槽說明書組裝凝膠電泳模具, 用移液槍吸取10%分離膠溶液, 沿隔板緩慢加入模具內(nèi)中, 避免產(chǎn)生氣泡,當(dāng)加入的溶液至前玻璃板2cm ～5mm的去離子水層,～30min，待凝膠聚合. TEMED要在注膠前再加入，, 避免產(chǎn)生氣泡。： Bradford 法屬于染料結(jié)合法, 即考馬斯亮藍(lán)G250 在酸性溶液中呈紅棕色,與蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色, 顏色深淺與蛋白濃度呈正比關(guān)系。[8]乙烯途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游事件是發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，由植物特有的核蛋白EIN3/EIL1所介導(dǎo)，EIN3是一個(gè)乙烯反應(yīng)的正調(diào)控因子。[2] 橡膠樹的分子生物學(xué)在各方面的研究都取得了一系列的成果，但相對(duì)于模式植物和糧食等經(jīng)濟(jì)作物來說，橡膠樹的分子生物學(xué)研究起步較晚，研究難度較大，研究明顯滯后。海南大學(xué)畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 題 目： 巴西橡膠樹乙烯途徑中抑制因子 Ein3的western印跡 學(xué) 號(hào)： 20110101310079 姓 名： 吳 立 杰 年 級(jí)： 11 級(jí) 學(xué) 院： 農(nóng) 學(xué) 院 系 別： 生 物 技 術(shù) 系 專 業(yè)： 生 物 技 術(shù) 指導(dǎo)教師： 翟 金 玲 副教授 完成日期： 摘 要天然橡膠是一種非常重要的工業(yè)原料，也是經(jīng)濟(jì)建設(shè)和國(guó)防建設(shè)不可缺少的稀缺資源和戰(zhàn)略物資，可以說它是現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的命脈,還是一種軍事和外交資源并且直接關(guān)系到國(guó)家的經(jīng)濟(jì)和政治的穩(wěn)定。目前，對(duì)于天然橡膠的生物合成途徑雖有一定的了解，與橡膠樹合成相關(guān)的一些基因也相繼克隆，并研究它們的一些基本功能，但所報(bào)道克隆的cDNA大都用異源同類基因從巴西橡膠樹構(gòu)建的cDNA文庫(kù)獲取，從巴西橡膠樹克隆的新基因不多，難以從整體水平上解釋膠乳再生的分子機(jī)制，此外橡膠樹死皮病發(fā)生的分子機(jī)理的相關(guān)研究也有待深入。[9]大部分與乙烯相關(guān)的生物學(xué)過程都通過核心轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1調(diào)控下游的靶基因來實(shí)現(xiàn)的。Bradford 法法測(cè)定蛋白濃度的范圍為31 .25 ～ 2 000 μg/mL。 按照試劑配方配置4%，用移液槍吸取濃縮膠溶液緩慢加入分離膠上面,直至凝膠溶液將要到達(dá)前玻璃板的頂端,插入梳子,凝膠聚合時(shí)間約30 min,然后小心拔出梳子,將凝膠放入電泳槽內(nèi),接好電極