畢業(yè)論文巴西橡膠樹乙烯途徑中抑制因子ein3的western印跡(文件)
【正文】 ：將清洗掉一抗的膜浸入用封閉液稀釋2000倍的二抗羊抗兔中，放入搖床，在37度60rpm下孵育23h。二氨基聯(lián)苯胺（DAB)是辣根過氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，所得產(chǎn)物為不溶于水、醇和二甲苯的棕色沉淀物而被廣泛用于蛋白免疫印跡。4結(jié)果與分析 method 定蛋白濃度（1）OD612數(shù)據(jù)記錄表Protein probeOD612 wert1OD612 wert2averageBSA（mg/ml）Sample 0h 1h 4h 6h 12h 24h（2）標準曲線（3）樣品蛋白濃度（OD612值代入y=+）樣品蛋白濃度(μg/μl)上樣量(μl)0h1h4h6h12h24h（1）Bradford數(shù)據(jù)記錄表Protein probeBradford wert1Bradford wert2averageBSA（mg/ml）0 000 Sample 0h 1h 4h 6h 12h 24h(2)標準曲線（3）樣品蛋白濃度（OD值代入y=+）樣品蛋白濃度(μg/μl)上樣量(μl)0h1h4h6216h12h24h（1）BCA數(shù)據(jù)記錄表Protein probeBCA wert1BCA wert2averageBSA（mg/ml） Sample 0h 1h 4h 6h 12h 24h(2)標準曲線（3）樣品蛋白濃度（OD值代入y=+）樣品蛋白濃度(μg/μl)上樣量(μl)0h1h4h6h12h24h三種定蛋白的方法所用到的牛血清蛋白和樣品蛋白是在同一條件下保存的同一試管中取得的，因此其蛋白濃度理論上應該是相等的，但是從三種方法的結(jié)果來看，不同方法所得的結(jié)果有一定的差距。本實驗主要采用的就是Esen method定蛋白濃度，用BCA法和Bradford法可以更好地驗證Esen method的精確性，同時也可大致確定所提取的橡膠葉片蛋白的濃度。P長期以來，翟老師不僅在實驗過程中幫助我，在我有疑惑時給予細心的指導，讓我學會了很多實驗的方法和技術，還在學習和生活上給予我關懷和鼓勵。另外，還要感謝王啟超師兄、范玉龍師兄等師兄師姐在我實驗出現(xiàn)困難時的幫助和對此實驗的支持。在此向翟金玲副教授致以衷心的感謝和崇高的敬意。致 謝本論文是在翟金玲副教授的悉心指導下完成的。從顯色的明暗程度來說，0h、1h、6h、12h的比較明顯，而4h的比較暗，而且24h的觀察不到蛋白的存在。相對于BCA法而言，Esen method和Bradford法所得樣品的OD值比較接近，且各個處理的濃度變化差異也相差不大。然后用移液槍加到二抗孵育后的PVDH膜上，在搖床上顯色1030min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）是過氧化物酶的生色底物，在過氧化氫存在的情況下失去電子從而呈現(xiàn)出顏色的變化和積累，形成淺棕色不溶性的產(chǎn)物。（7）一抗孵育與清洗： ①一抗孵育：將膜從封閉液中取出浸入用封閉液稀釋1000倍的一抗Ein3中，放入搖床，在37度60rpm下孵育23h。（6）交聯(lián)和封閉： ①將膜取出后，先用去離子水清洗，然后入1TBS中浸洗5min，%戊二醛的TBS中交聯(lián)45min。然后將夾板放入轉(zhuǎn)移槽中，黑板相對黑極，白板對白極(正極）。（2）平衡：將膠放入轉(zhuǎn)移液中在搖床上平衡以除去SDS。然后一塊膠進行染色脫色，另一塊膠進行轉(zhuǎn)膜及后續(xù)工作。在凝膠的左邊第一個孔中各加入6μl的雙色預染寬分子量蛋白Marker。（9） 記錄數(shù)據(jù)并做標準曲線（相似度R178。（5） 棄去蛋白固定液后加入Esen staining buffer在搖床上染色15min。[2] method（1） 在高通量蛋白定性濾紙上畫出1cm1cm的方格。[1] BCA 法的測定原理為蛋白質(zhì)價銅離子還原成亞銅離子,
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