【正文】 召開了土壤緊急會議。這個延伸的觀點似乎更適合于土壤環(huán)境的復(fù)雜性。 4 圖 2 外界因素決定多樣性，反過來影響生態(tài)系統(tǒng) 特性，像穩(wěn)定性、抵抗力、豐富度和生產(chǎn)力 生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相關(guān) 理論 的出現(xiàn) 已經(jīng)有近 50 年了，并且被認(rèn)為是早期生態(tài)學(xué)理論的核心法則。這是因為在這種條件下具有優(yōu)勢的物種在各處有利的小生境中都會受到偏愛。如果大量的物種負(fù)責(zé)簡單的功能，任何物種的消失對于土壤過程都不會有任何的影響，因為其他的有機體會填充這個功能空隙。 Yan等發(fā)現(xiàn)有機 C 和功能多樣性之間存在一個斷棍的關(guān)系，并且他們也重新計算了 Sharma 等給出的數(shù)據(jù)，該作者曾經(jīng)說發(fā)現(xiàn)了H’和微生物生物量 之間存在線性關(guān)系。 中等分辨率的 方法包括系統(tǒng)發(fā)育探針的應(yīng)用，或者是群落 DNA 或者 RNA 的空位或者點墨法雜交，或者是完整的細(xì)胞熒光原位雜交。即使 這種方法被認(rèn)為分辨率很低，但是它可以用來指示整個微生物群落結(jié)構(gòu)的整個變化，尤其是多樣性很低的情況。 用 未處理的天然土壤作為對照。低分類學(xué)水平的測定，高分辨率 比較分析微生物種群動力學(xué)，微生物系統(tǒng)發(fā)育或功能屬的多樣性 PCRRISA 種群或者系統(tǒng)發(fā)育組的遺傳指紋圖譜，同時分析不同的微生物屬，在物種或?qū)俚乃缴蠝y定。在理論上，BAC 文庫可以 容納全部的微生物群落基因組，并且可以用來繪制基因組圖譜、篩選特殊物種、評估系統(tǒng)發(fā)育分析和功能多樣性。這種分離是基于 在一個線性變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中 PCR擴增的 DNA分子具有不同的遷移率。在 SSCP 中，一個引物是在 5’端磷酸化的，并且擴增物中磷酸化的鏈被 λ 核酸外切酶選擇性的酶切。 這些分析方法已經(jīng)被用來區(qū)分群落和研究土壤中的群落結(jié)構(gòu)和動力學(xué)。特殊引物也適用于檢測特殊基因，例如類芽孢桿菌，布克氏菌和桿菌。每個細(xì)胞的低生理活性往往與低核糖體含量有關(guān)，因此，低生長率或者餓死的細(xì)胞就有可能檢測不出來。 PCR 聯(lián)合 DGGE 顯示，這兩種 土壤中的不同細(xì)菌類型的數(shù)量很高，這意味著這兩種土壤多樣性物種豐 度很高。在重度金屬污染的土壤中孤立群的數(shù)量和 α變形菌亞綱的克隆變化明顯，克隆數(shù)比例是 38%，孤立群僅只有 14%。隨后， De Leij 等作了研究 ，使用標(biāo)記基因 改造菌株后釋放進(jìn)田間， 調(diào)查插入基因 對各種組成成分生態(tài)競爭力 潛在的代謝壓力 。這些可以通過一系列的常規(guī)的工具和先進(jìn)的分子技術(shù)來實現(xiàn)，這在其他的章節(jié)已有敘述。 至今，只有一少部分研究是關(guān)于分析田間條件下轉(zhuǎn)基因植物對根圍土壤的細(xì)菌群落組成的潛在影響的。 在某些情況下，檢測到的某些樣品中的一個或者其他所有的品種的根圍群落結(jié)構(gòu)差異不是由于產(chǎn)生 T4 熔解酵素，而是極有可能與品種的成長特征不同有關(guān)。 Demaneche 等最近 20 發(fā)現(xiàn)可以自然轉(zhuǎn)化 的細(xì)菌數(shù)量比估計的要多。 隨著植物的衰老和土壤中微生物對于植物殘體的降解，轉(zhuǎn)基因 DNA 也能隨著被降解。但是，在剛開始種植轉(zhuǎn)基因植物時并沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 不能排除不同的環(huán)境生態(tài)位中發(fā)生植物和細(xì)菌之間的基因水平轉(zhuǎn)移，但是這種稀有事件的生態(tài)影響取決于其本身已具有的特性的選擇和散播。 這突出了像熱帶雨林、珊瑚礁等這種復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的弱點。但是，當(dāng)這個過程發(fā)生時，觀察到的轉(zhuǎn)化頻率是很低的。事實上，轉(zhuǎn)基因植物對于微生物群落 23 的相關(guān)影響比與季節(jié)、田地位置和年份等環(huán)境因素引起的一般變化會更加深遠(yuǎn)。 毫無疑問，現(xiàn)在人類和動物醫(yī)學(xué)上的問題是由于在 醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)中 毫無限制的使用抗生素 造成的，而不是由于使用攜帶抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物所造成。但是， Nielsen 等發(fā)現(xiàn)，棲居土壤中的沒有實力的 Aciobacter 細(xì)胞在增加營養(yǎng)后會變成有能力的細(xì)胞。而且對于含有 10bp 被刪除的 nptII 基因的 Aciobacter 細(xì)胞來說，從各種各樣的攜帶 nptII 標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因植物 （例如馬鈴薯、煙草、甜菜、 甘藍(lán)型油菜 和番茄）中轉(zhuǎn)化 DNA 會導(dǎo)致細(xì)菌基因組整合不完整的 nptII 基因。 Gebhard 和 Smalla 等在田間釋放具有轉(zhuǎn)基因 抗叢根病的甜菜然后研究其轉(zhuǎn)基因DNA 在土壤中的留存。自然轉(zhuǎn)化 是指有能力的細(xì)菌可以通過敏感性的 DNA酶來獲得自由 DNA的過程。第二種方法是使用 Biolog GN 微平板分 析群落分解代謝的功能單元。 轉(zhuǎn)基因植物對于根圍 微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能組成的影響在小規(guī)模水平的田間釋放研究比較理想 ，因為研究顯示 ，溫室觀察與田間條件 存在很大的不同。 微生物制劑的國際標(biāo)準(zhǔn)不同的國家都不一樣。至今研究最多的轉(zhuǎn)基因微生物制 劑有根瘤菌屬、假單胞菌屬和固氮螺菌屬，這些細(xì)菌已經(jīng)被用來在田間規(guī)模做種子保護劑以測試其效果，也以此深入的研究其試用的安全相關(guān) 17 的方面，例如它們在土壤環(huán)境 中 的命運。 這個群體在低 金屬 污染的土壤中的豐富度是高 金屬 污染土壤的兩倍。這兩種土壤有相似的質(zhì)地（砂壤土），并且坐落于挪威西部 400 米遠(yuǎn)。 已經(jīng)證實，通過使用系統(tǒng)發(fā)育探針， 群落指紋圖譜的點跡和 Southern印跡雜交 在研究群落變化和鑒定大量 的優(yōu)勢群落成員時很有效。同時使用許多引物靶標(biāo)相同樣品中的不同的系統(tǒng)發(fā)生基團可以評估一個群落中的不同微生物種型的種群動力學(xué)。然后擴增物通過限制性酶切再進(jìn)行凝膠或者毛細(xì)管凝膠電泳分離。 DGGE/TGGE 方法分析 從反轉(zhuǎn)錄 PCR 的 rRNA 分子獲得的 PCR 擴增物或許可以得出代謝活躍的微生物種群的指紋圖譜?；?PCR 的群落指紋圖譜技術(shù)有許多的優(yōu)點， 包括：快速，可以平行分析大量的樣品；可靠，高度的可重復(fù)性；提供一個群落里的種群的性質(zhì)和數(shù)量上的信息；可以通過比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫中的序列來評價群落成員之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。從土壤微生物 群落中提取的 DNA 通常很復(fù)雜，重聯(lián)率也很低，但是如果在檸檬酸鹽溶液和 30%DMSO 中測量時它將會提高。低分辨率 整體分析群落的遺傳可能性，比較分析全部的生物多樣性 摩爾 %G+C 組成 群落遺傳圖譜，整個群落組成。重聯(lián)的 DNA 部分可以通過 C0t 值 來反映，其中 C0是指摩爾核苷酸每升， t 是指以秒計算的時間。 5 用總基因組 DNA 方法來分析生物多樣性 土壤微生物群落的組成情況可以通過檢測群落 DNA 的堿基差異 [摩爾 %鳥嘌呤 +胞嘧啶（ %G+C） ]來獲得。 圖 7 縱覽分析微生物群落的非培養(yǎng)的分子生物方法。此外，用這種方法不能檢測出真菌對土壤功能的作用。植物和動物水平的結(jié)構(gòu)比土壤微生物水平的結(jié)構(gòu)要明顯。我們將討論其中的資源不均一性假設(shè)和保險假設(shè)。另外，在土壤中，多樣性的空間變化跟根圍和大塊土、大塊土壤和顆粒土壤、大孔隙和小孔隙和不同的范圍等有著很重要的關(guān)系 我們 都知道有很多因素會影響多樣性 ，至少在理論上會影響。 3 微生物多樣性通常被認(rèn)為是不同分類的生物個體的數(shù)量以及它們在分類學(xué)中的分布。 土壤微生物群的組成變化對土壤功能完整性很關(guān)鍵。 但必須強調(diào)的是，公眾關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的討論不應(yīng)該把注意力轉(zhuǎn)移開細(xì)菌具有抗性的真正原因，例如醫(yī)生和畜牧業(yè)中的持續(xù)濫用和過量使用抗生素。 A. Benedetti轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 隨著老化或者退化的植物體 或者花粉進(jìn)入土壤。 雖然由于城市化發(fā) 展、侵蝕、森林采伐和污染的蔓延，每年損失上百萬公頃的土地，但是，這個問題一直 沒有受到 應(yīng)有的重視 。 2 土壤微生物多 樣性和功能多樣性和生態(tài)學(xué)理論的作用 迄今為止 ， 生態(tài)學(xué)理論一直致力于研究地上系統(tǒng)。土壤 在很大程度上是典型的巨大的分層生境，有不同水平層次的 范圍，每一個范圍都可以視為一個獨立的整體。所以，高多樣性的群落會更加穩(wěn)定。 Griffiths 等證實，當(dāng)土壤微生物多樣性很低時，面對短時間的壓力（短時間 40℃ ）微生物功能性恢復(fù)受到消極的影響。這種方法采用了包含 95 種 C 源的微平板。 這些微生物核苷酸信息可以用來觀察和比較不同系統(tǒng)水平的多樣性，從物種變化到群落多樣性都可以。 高等分辨率的方法包括非編碼 DNA 區(qū)域的指紋識別（例如 repPCR擴增重復(fù)性序列）和 編碼區(qū)及 非編碼區(qū)的測序。 從微生物群落分離出來的 DNA 復(fù)雜性是對總遺傳多樣性的一個估計。 圖 8 大腸桿菌的 DNA 的重新組合（ C0t，其中 C0代表摩爾核苷酸每升， t代表時間 /秒），或未處理土壤中的細(xì)菌部分（ K），厭氧條件下的土壤（ N2）和 CH4作為主要碳源的土壤（ CH）（ 216。 C0代表摩爾核苷酸每升， t 代表時間 /秒 為了估計原核生物的多樣性， DNA必須高度純化并且與真核生物的 DNA區(qū)分開來。 Tiedje 等質(zhì)疑微生物是世界性的這個假說，他們發(fā)現(xiàn)每一相同大陸區(qū)域每一個 取樣點微生物的基因型都是特異性的。群落的分類學(xué)組成信息可以通過凝膠印跡和與遺傳分子探針雜交、靶標(biāo)細(xì)菌和古生菌中的主要的系統(tǒng)發(fā)育亞種。 TRFLP方法是基于對末端熒光標(biāo)記的 PCR擴增物進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶酶切的一種方法。這種方法成功地被用來分類菌株和指紋鑒定簡單的群落和混合的種群。在熒光原位雜交方法中，系統(tǒng)發(fā)育探針被用熒光染料 標(biāo)記然后用來做環(huán)境樣品的單細(xì)胞的原位檢測 （整個細(xì)胞雜交）。對 這些克隆的 rRNA 基因進(jìn)行測序 ， 然后與數(shù)據(jù)庫中的進(jìn)行比較可以得出克隆序列之間的聯(lián)系。 這些探針適用于總細(xì)菌群落（ FISH），細(xì)菌單體和基于 PCR的 16S rRNA克隆文庫（空位印跡雜交）。對于縮寫，見圖 7 8 轉(zhuǎn)基因微生物對微生物群落的影響 微生物接種菌在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中已經(jīng)應(yīng)用超過每年 3 億公頃，其中的一些有歷史安全使用記錄的始于 1896 年（知名的根瘤菌，用來接種豆科植物）或者 19 世紀(jì) 30 年代（例如蘇 云金芽孢桿菌，用來生物防治無脊椎害蟲）。 然而，關(guān)于接種轉(zhuǎn)基因微生物的影響并沒有直接涉及微生物多樣性的問題，大多數(shù)集中于其他風(fēng)險 評估方面的，例如它們在環(huán)境中的抵抗力和根圍的定植能力。如前所述，基于核苷酸分析微生物群落可以克服培養(yǎng)方法的缺陷。產(chǎn) T4 熔解酵素兩排，一排是沒有 T4 熔解酵素基因的和另一排 父本，在兩個相距很遠(yuǎn)的田間位置和不同的土壤類型的情況下，連續(xù)觀察了 3 年多。 轉(zhuǎn)基因植物對于土壤微生物群落的影響比在季節(jié)和田間位置等環(huán)境因素下的影響似乎更相關(guān)。不同的研究也發(fā)現(xiàn)在微生境和田間條件下轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 有長時間的留存。許多人 之所以 沒有檢測到轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)菌之間的水平基因轉(zhuǎn) 移，大概是因為細(xì)菌中缺 21 少同源序列或者使用了低轉(zhuǎn)化率的細(xì)菌。 現(xiàn)在關(guān)于自然轉(zhuǎn)化過程的不同步驟已經(jīng)研究得很透徹了，從細(xì)胞 DNA 的釋放到它的留存到它被有能 力的細(xì)菌整合的可用性。細(xì)菌本身的遺傳可 塑性是抗生素抗性出現(xiàn)的一個很大的原因。測定限制整個土壤代謝速率的反應(yīng)速率可以減少實驗的工作量，并且不會影響評估土壤代謝活力。這種結(jié)合的方法可以更好的理解微生物多樣性和土壤功能之間的聯(lián)系。 盡管使用分子生物方法可以 較好的鑒定土壤中微生物多樣性，但是關(guān)于微生物多樣性和土壤功能性之間的關(guān)系仍然不是很清楚。因 22 為細(xì)菌可以在不同的環(huán)境和不同的地理區(qū)域之間傳播，人們需要獲得 細(xì)菌抗性的全球性流行的 數(shù)據(jù)，選擇和擴散比以前有了更加廣泛的途徑。 與染色體或者質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化相比，當(dāng)起始就過濾轉(zhuǎn)化 Aciobacter 的實驗更深一步并且在無菌和非無菌土壤中進(jìn)行時，與植物 DNA 或植物勻漿之間的轉(zhuǎn)化頻率會劇烈的下降。 在田間種植的轉(zhuǎn)基因馬 鈴薯的根圍經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)表達(dá) T4 熔解酵素的馬鈴薯的重組DNA。目前，眾多 課題組 對于環(huán)境條件下的自然轉(zhuǎn)化 主要有兩方面： （ 1）自由 DNA 可以持續(xù)多長時間，例如在土 壤中；這些 DNA 依然可用于自然變換么？ （ 2） 在環(huán)境條件下不同的細(xì)菌物種有多少能達(dá)到可以自然變換的狀態(tài)？ 實驗室條件下發(fā)現(xiàn)了基因的瞬間轉(zhuǎn)移，這提供了理解植物 DNA 轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中的另外一條可能途徑。盡管只有細(xì)菌群落中的一小部分與 Biolog類型有關(guān)，但是細(xì)菌群落的分解代謝潛能的差異可以定性定量的檢測出來。 其他變種 19 的差異似乎主要是由土壤類型的影響。 是不是人們覺得轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物種群的影響可以忽略，或者說至少與其他轉(zhuǎn)基因生物安全性 18 問題相比不是很重要，例如抑制雜草物種、對非靶標(biāo)生物的影 響或者新的病毒的出現(xiàn)。