【正文】 四年的風(fēng)風(fēng)雨雨，我們一同走過，充滿著關(guān)愛，給我留下了值得珍藏的最美好的記憶。本次畢業(yè)設(shè)計(jì)是對(duì)我大學(xué)四年學(xué)習(xí)下來最好的檢驗(yàn)。 我的實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室湯偉師姐的幫助下完成，同時(shí)得到了劉露、張軍霞師姐的耐心指導(dǎo)，在此一并表示衷心的感謝。 因此，在 應(yīng)用 過程中應(yīng)給予幾丁質(zhì)酶 35 ℃ 以 下 、 偏酸性環(huán)境 ，這有利于提高酶的水解能力。 表 2 各種試劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響 Tab. 2 Effects of different regents on chitinase activity 試劑 濃度 相對(duì)酶活（ %） 試劑 濃度 相對(duì)酶活（ %） SDS %w/v L半胱氨酸 1mmol/L 1%w/v 5mmol/L 尿素 3mol/L 5% EDTA 1mmol/L 乙醇 1% 10mmol/L 5% β 巰基乙醇 1mmol/L 異丙醇 1% 10mmol/L 5% Na2SO4 1mmol/L 丙三醇 1% 5mmol/L 5% 幾丁質(zhì)酶底物特異性測定 幾丁質(zhì)酶 底物特異性試驗(yàn)結(jié)果如下表 3，幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)有水解活性，而對(duì)粉末狀幾丁質(zhì)和殼聚糖無水解活性 ,說明該幾丁質(zhì)酶特異性降解 膠體幾丁質(zhì)。 圖 3 酵母工程菌表達(dá)幾丁質(zhì)酶的 SDSPAGE 分析 純：純化后幾丁質(zhì)酶酶液； M：標(biāo)準(zhǔn)分子量 蛋白（低）； 17： 17 天的粗酶液； CK：轉(zhuǎn)pPIC9K 空載體的畢赤酵母 GS115 菌株的表達(dá)產(chǎn)物 Fig. 3 SDSPAGE analysis of expression chitinase from GStachit1K Pure: enzyme solution of purified chitinase。 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適 pH 值 10 用廣泛 pH緩沖液將酶反應(yīng)體系 pH 值調(diào)為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 測定幾丁質(zhì)酶活性。 ②3 % 濃縮膠凝膠液：取 mL 30 % 凝膠儲(chǔ)液， mL 濃縮膠緩沖液， μl 10 % SDS ， mL ddH2O， 15 μL 10 % 過硫酸銨， 10 μL TEMED ，混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。 ③ 取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每試管加入 3 mL 蒸餾水，混勻。 ② 逐步加入 NaOH 溶液（ 20 g 溶于水），不斷攪拌至溶液清澈透明。 （ 2）常用培養(yǎng)基的制備 ①BMGY 培養(yǎng)基：稱取 5 g 酵母提取物， 10 g 胰蛋白胨，溶于 350 mL 蒸餾水中，高壓滅菌 20 min，然后冷卻至室溫，再加入 50 mL 10YNB 、 1 mL 500B 、50 mL 10GY 、 50 mL 1 mol/L K3PO4（ pH ），最后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? 幾丁質(zhì)酶應(yīng)用范圍非常廣，具有巨大的開發(fā)潛力，對(duì)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、自然資源的利用、生物防治、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥衛(wèi)生等都具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 然而自然界中的幾丁質(zhì)幾乎以相等的速率產(chǎn)生和消失， 在這個(gè)過程中 ， 微生物起了非常重要的作用。 3 結(jié)論與討論 ....................................... 錯(cuò)誤 !未定義書簽。 N乙酰氨基葡萄糖（ NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 ........ 錯(cuò)誤 !未定義書簽。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人離校后發(fā)表或使用該畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）或與該論文（設(shè)計(jì)）直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，單位署名為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)。 實(shí)驗(yàn)材料 ....................................... 錯(cuò)誤 !未定義書簽。 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度 ......................... 錯(cuò)誤 !未定義書簽。 本 研究結(jié)果 為 該酶的 研究和開發(fā) 利用 提供了 科學(xué)依據(jù)。 此后 ， 人們又相繼從多種微生物 （ 包括細(xì)菌、放線菌、真菌 ）、 植物及動(dòng)物中分離到幾丁質(zhì)酶 ， 4 并對(duì)幾丁質(zhì)酶的理化特性及生物學(xué)活性進(jìn)行了大量的研究。5H 2O， CaCl2， MnCl2， FeSO4 ⑧ 固定液：取 45 mL 95%乙醇， 10 mL 冰醋酸，加 100 mL 蒸餾水。 （ 3） 將培養(yǎng)液置于 500 mL 搖瓶中， 用 雙層 紗布封口，在搖床中 2830 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并開始誘導(dǎo)表達(dá)（注意溫度不要超過 30 ℃ ）。將發(fā)酵液 5000 r/min 離心 1015 min，收集上清液 即為粗酶液 。 （ 3）染色及脫色 ① 將電泳完畢的凝膠取出，用去離子水沖洗，然后放到考馬斯亮藍(lán) R250染色液中染色，過夜。 2 結(jié)果與分析 N乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 以 N乙酰氨基葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，在 540 nm 波長下測定 OD540值為縱坐標(biāo) ， 作出 標(biāo)準(zhǔn) 曲 線 （ 圖 1 ）， 回歸 方 程為 y = – 。 當(dāng) pH 超過 時(shí)酶活性 迅速 降低，在 pH 為 時(shí)，幾丁質(zhì)酶基本沒有活性。 據(jù)報(bào)道， 粘質(zhì)沙雷氏菌 （ S. marcescens） 表達(dá)五種幾丁質(zhì)酶 ， 其分子量分別為 2 3 4 52 和 57KDa，而紅色鏈霉菌 （ S. erythraeus） 則僅產(chǎn)生一種 [12,13]， 分子量為 30KDa。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)微生物幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)研究，為幾丁質(zhì)酶研究及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體均已在文中以明確方式標(biāo)明。 另外，我還要感謝大學(xué)四年和我一起走過的同學(xué)朋友對(duì)我的關(guān)心與支持，與他們一起學(xué)習(xí)、生活，讓我在大學(xué)期間生活的很充實(shí)，給我留下了很多難忘的回憶。 。再次對(duì)周巍老師表示衷心的感謝。 論文密級(jí)： □ 公開 □ 保密 （ ___年 __月至 __年 __月） (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 作者簽名： _______ 導(dǎo)師簽名： _______ _______年 _____月 _____日 _______年 _____月 _____日 21 獨(dú) 創(chuàng) 聲 明 本人鄭重聲明：所呈交的畢業(yè)設(shè)計(jì) (論 文 )，是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果，成果不存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭議。 本試驗(yàn)所研究的 GStachit1K 表達(dá)的幾丁質(zhì)酶 特異性降解膠體幾 丁質(zhì) 。因此，在 應(yīng)用 過程中應(yīng)避免 上述 金屬離子和 試劑的干擾 。 0204060801003 . 0 3 . 5 4 . 0 4 . 5 5 . 0 5 . 5 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5 9 . 0 9 . 5 1 0 . 0pH相對(duì)酶活（%） 圖 5 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適 pH Fig. 5 The optimum pH value of chitinase reaction 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果見圖 6，幾丁質(zhì)酶在 35 ℃ 以 下 是 比較穩(wěn)定 的 ， 50 ℃ 下 處理 1 h，殘余酶活為 12 %， 55 ℃ 處理 10 min 后 幾丁質(zhì)酶沒有活性。 變性劑 、 蛋白抑制劑 和有機(jī)溶劑 對(duì)酶活性的影響 在幾丁質(zhì)酶反應(yīng)體系中加入不同的變性劑 、 蛋白抑制劑 和 有機(jī)溶劑 ，使 SDS終濃度分別為 % 和 %(w/v)，尿素終濃度分別為 mol/L 和 mol/L，EDTA、 β 巰基乙醇終濃度為 1 mmol/L 和 10 mmol/L， Na2SO L半胱氨酸終濃度為 1 mmol/L 和 5 mmol/L，而甲醇、乙醇、異丙醇、丙三醇終濃度為 1 %和 5 %，在 50 ℃ 下反應(yīng) 1 h 后，以 反應(yīng)體系中 不加任何 試 劑的酶活 性 為 100 %，分別測定加入不同變性劑 、 蛋白抑制劑 和有機(jī)溶劑 后反應(yīng)體系中幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。混勻后在沸水中煮 10 min，冷卻后用微量加樣器將 25 μL 樣品和低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分別注入加樣孔中。 幾丁質(zhì)酶的分離純化 粗酶液的制備 根據(jù)分析最佳收獲時(shí)間為 7 d。 實(shí)驗(yàn)方法 酵母工程菌的培養(yǎng)和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá) （ 1）挑取 GStachit1K 單菌落，接種到含 25 mL BMGY 培養(yǎng)基的 250 mL搖瓶中，用紗布封口，放到搖床中， 28 ℃ 、 130 r/min 振蕩培養(yǎng) 3 d 至對(duì)數(shù)生長期（ OD600為 26）。 ⑥ 樣品緩沖液：取 1 mL TrisHCl 緩沖液， g SDS， g 溴酚藍(lán)， 2 mL甘油， mL β 巰基乙醇，加 10 mL 蒸餾水溶解。 1 材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料 供試菌株 酵母工程菌 GStachit1K、轉(zhuǎn) pPIC9K 空載體的畢赤酵母 GS115 菌株（未導(dǎo)入 幾丁質(zhì)酶 基因） 由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。早在 1905年 Benecke就首次分離到了能利用幾丁質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)的微生物 ， 并定名為 Bacillus chitinovirous （ 溶幾丁質(zhì)芽孢桿菌） ， 但當(dāng)時(shí)并沒有關(guān)于幾丁質(zhì)酶活性方面的直接證據(jù) 。結(jié)果表明 該酶 的最適 反應(yīng)溫度為 50 ℃ ， 在 35 ℃ 以下相對(duì)穩(wěn)定， 最適反應(yīng) pH值為 ， 在 pH 。 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測定 ....................... 錯(cuò)誤 !未定義書簽。 引言 ............................................... 錯(cuò)誤 !未定義書簽。 論文（設(shè)計(jì)）作者簽名： 日期： 年 月 日 畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）版權(quán)使用授權(quán)書 本畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）作者同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文（設(shè)計(jì)）的復(fù)印件和電子版，允許論文（設(shè)計(jì)）被查閱和借閱。 作者簽名： 日期： 年 月 日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。 幾丁質(zhì)酶的分離純化 ........................... 錯(cuò)誤 !未定義書簽。 討論 ........................................... 錯(cuò)誤 !未定義書簽。幾丁質(zhì)也可經(jīng)脫乙酰作用形成脫乙酰幾丁質(zhì)（ chitosan），脫乙酰幾丁質(zhì)又可進(jìn)一步被脫乙酰幾丁質(zhì)酶（ chitosanase）分解成氨基葡萄糖 [2]。隨著 DNA 重組技術(shù)不斷發(fā)展，通過構(gòu)建遺傳工程菌株，克隆各種天然酶的基因，使其在微生物系統(tǒng)中得以高效表達(dá)，從而 克服上述困難 。 （ 3） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制 6 ①30 % 凝膠儲(chǔ)液：稱取 g Acr， g Bis，加 100 mL 蒸餾水溶解。 ④45 ℃ 水浴，同時(shí)加水不斷攪拌至全溶。 ⑤ 以 NAG 濃度（ mg/mL）為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。凝聚后用濾紙吸出膠面上的水。 幾丁質(zhì)酶的 熱穩(wěn)定性 先將酶液