【正文】 （ 3）染色及脫色 ① 將電泳完畢的凝膠取出，用去離子水沖洗，然后放到考馬斯亮藍(lán) R250染色液中染色，過(guò)夜。凝聚后小心拔出梳子，在玻璃 板兩側(cè)倒入電極緩沖液。 9 （ 2）電泳操作 [9] ① 按照順序安裝玻璃板，然后沿兩板縫隙加入 15 % 融化的瓊脂，待瓊脂凝固后加入現(xiàn)配的 12 % 分離膠凝膠液，至膠面距低板邊緣 3 cm 左右，然后用滴管在膠面上輕輕鋪?zhàn)?1 cm 水層，垂直放置膠板，室溫下放置 30 min 待膠凝聚。透析完全后，將透析液以 5000 r/min 離心 15 min，取上清液， 80℃ 保存。將發(fā)酵液 5000 r/min 離心 1015 min，收集上清液 即為粗酶液 。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 得出 還原糖的含量，然后計(jì)算酶活。 ④ 測(cè) 540 nm 處的吸光值， 以蒸餾水為空白調(diào)零，每組 3 個(gè)重復(fù)。樣品用于制作產(chǎn)酶曲線和蛋白電泳。 （ 3） 將培養(yǎng)液置于 500 mL 搖瓶中， 用 雙層 紗布封口，在搖床中 2830 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)（注意溫度不要超過(guò) 30 ℃ ）。 （ 6）廣泛 pH緩沖液 稱取 g 檸檬酸 、 g 磷酸二氫鉀 、 g 硼酸 、 g 巴比妥 ， 加 1 L 蒸餾水溶解。 ③ 然后加入 91 g 酒石酸鉀鈉， g 苯酚和 g 無(wú)水亞硫酸鈉。 ② 向溶液中加入 500 mL 50 % 乙醇，不斷攪拌至析出膠體，然后 5000 r/min離心 5 min，棄掉上清液。 ⑧ 固定液：取 45 mL 95%乙醇， 10 mL 冰醋酸，加 100 mL 蒸餾水。 ④ 電極緩沖液：稱取 g SDS， 9 g Tris， g 甘氨酸，加 1500 mL蒸餾水溶解。 ②BMMY 培養(yǎng)基：稱取 5 g 酵母提取物， 10 g 蛋白胨，溶于 350 mL 蒸餾水中，高壓滅菌 20 min，然后冷卻至室溫，再加入 50 mL 10YNB 、 1 mL 500B 、 50 mL 10M 、 50 mL 1 mol/L K3PO4（ pH ），最后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? ③10GY （ 10 % Glycerol，甘油）：將 10 mL 甘油與 90 mL 蒸餾水混合，高壓滅菌 20 min 后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?H 2O， CaCl2， MnCl2， FeSO4 畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，它克服了釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的諸多不足，成為國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的大量生產(chǎn)外源真核蛋白的較為理想的表達(dá)系統(tǒng)。 近年來(lái)，微生物幾丁質(zhì)酶的研究備受關(guān)注，但天然酶在生物體內(nèi)的含量 一般較低且容易受到底物和環(huán)境的影響，這對(duì)幾丁質(zhì)酶大量提取和制備造成了困難。 根據(jù)作用方式和酶解產(chǎn)物，幾丁質(zhì)酶可以分為：內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（ endochitinase）、外切幾丁質(zhì)酶（ exochitinase）和幾丁二糖酶（ chitbiosidase）。 此后 ， 人們又相繼從多種微生物 （ 包括細(xì)菌、放線菌、真菌 ）、 植物及動(dòng)物中分離到幾丁質(zhì)酶 ， 4 并對(duì)幾丁質(zhì)酶的理化特性及生物學(xué)活性進(jìn)行了大量的研究。 溫和、高效、無(wú)污染的生物酶法 已 成為研究的熱點(diǎn) [3]。 細(xì)菌和真菌所分泌的幾丁質(zhì)酶可將幾丁質(zhì)中的 β 1,4 糖苷鍵水解，最終分解為 N乙酰β D葡萄糖胺。 Enzymatic Characterization 3 引言 幾丁質(zhì)（ chitin）又稱甲殼素、甲殼質(zhì)或幾丁聚糖，是 N乙酰 β D葡萄糖胺（ NAcetylβ DGlucosamine，簡(jiǎn)稱 NAG）以 β 1,4 糖苷鍵聚合而形成的直鏈形大分子 ， 廣泛存在于自然界中， 主要來(lái)源于蝦、蟹、昆蟲(chóng)等甲殼類動(dòng)物的外殼與軟件動(dòng)物的器官（例如烏賊的軟骨），以及 真菌 （ 如酵母、霉菌 ）的細(xì)胞壁中 ， 是除蛋白質(zhì)外地球上數(shù)量最大的含氮天然有機(jī)化合物。 本 研究結(jié)果 為 該酶的 研究和開(kāi)發(fā) 利用 提供了 科學(xué)依據(jù)。 參考文獻(xiàn) ........................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 結(jié)論 ........................................... 錯(cuò)誤 !未 定義書(shū)簽。 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響 ..................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度 ......................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 2 結(jié)果與分析 ....................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測(cè)定 ..................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 主要儀器設(shè)備 ................................. 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 實(shí)驗(yàn)材料 ....................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 作者簽名： 日期： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 日期： 年 月 日 指導(dǎo)教師評(píng)閱書(shū) 指導(dǎo)教師評(píng)價(jià)： 一、撰寫（設(shè)計(jì)）過(guò)程 學(xué)生在論文（設(shè)計(jì)）過(guò)程中的治學(xué)態(tài)度、工作精神 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 學(xué)生掌握專業(yè)知識(shí)、技能的扎實(shí)程度 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)和專業(yè)技能分析和解決問(wèn)題的能力 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 研究方法的科學(xué)性；技術(shù)線路的可行性；設(shè)計(jì)方案的合理性 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 完成畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）期間的出勤情況 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量 論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件） ？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 三、論文（設(shè)計(jì)）水平 論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問(wèn)題的指導(dǎo)意義 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 論文（設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)）所體現(xiàn)的整體水平 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 建議成績(jī)： □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 （在所選等級(jí)前的□內(nèi)畫(huà)“√”） 指導(dǎo)教師： （簽名） 單位： （蓋章） 年 月 日 評(píng)閱教師評(píng)閱書(shū) 評(píng)閱教師評(píng)價(jià)： 一、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量 論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 二、論文（設(shè)計(jì)）水平 論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問(wèn)題的指導(dǎo)意義 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 論文（設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)）所體現(xiàn)的整體水平 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 建議成績(jī)： □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 （在所選等級(jí)前的□內(nèi) 畫(huà)“√”） 評(píng)閱教師： （簽名） 單位： （蓋章） 年 月 日 教研室（或答辯小組）及教學(xué)系意見(jiàn) 教研室（或答辯小組）評(píng)價(jià)： 一、答辯過(guò)程 畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的基本要點(diǎn)和見(jiàn)解的敘述情況 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 對(duì)答辯問(wèn)題的反應(yīng)、理解、表達(dá)情況 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 學(xué)生答辯過(guò)程中的精神狀態(tài) □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量 論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 三、論文（設(shè)計(jì)）水平 論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問(wèn)題的指導(dǎo)意義 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否 有創(chuàng)意？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 論文（設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)）所體現(xiàn)的整體水平 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 評(píng)定成績(jī)： □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 （在所選等級(jí)前的□內(nèi)畫(huà)“√”） 教研室主任（或答辯小組組長(zhǎng)）： （簽名） 年 月 日 教學(xué)系意見(jiàn)： 系主任： （簽名） 年 月 日 目錄 摘要 ............................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。 作 者 簽 名： 日 期： 指導(dǎo)教師簽名： 日 期： 使用授權(quán)說(shuō)明 本人完全了解 大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的 規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務(wù)；學(xué)?？梢圆捎糜坝?、縮印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學(xué)?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉?jī)?nèi)容。本人離校后發(fā)表或使用該畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）或與該論文（設(shè)計(jì)）直接相關(guān)