【正文】 （ 2） 篩選出貝類生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因70 個(gè) 、抗病功能基因 1015 個(gè)、 與貝類珍珠質(zhì)形成相關(guān)的功能基因510 個(gè) ，建立家系等遺傳育種材料。 功能基因驗(yàn)證 ：明確 35 個(gè)功能基因與珍珠質(zhì)量的相關(guān)性，闡明其表達(dá)調(diào)控規(guī)律及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；確定 45種基質(zhì)蛋白在珍珠質(zhì)形成過(guò)程中的調(diào)控作用。 2）牡蠣全基因組注釋及功能基因的規(guī)模開(kāi)發(fā) ：借助生物信息學(xué)分析軟件，對(duì)全基因組圖譜進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)分析、基因功能注釋 與 分類，開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組研究，豐富已有的 EST 和 cDNA 資源，規(guī)模開(kāi)發(fā)功能基因。 已建成一支高素質(zhì)的研究團(tuán)隊(duì) 經(jīng)過(guò)國(guó)家多年的連續(xù)支持，在國(guó)內(nèi)已經(jīng)形成以中國(guó)科學(xué)院海洋研究所、中國(guó)海洋大學(xué)、廈門(mén)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院南海海洋所 、 清華大學(xué) 、海南大學(xué)、深圳華大基 因研究院 等單位為主的基因組學(xué) 、生物信息學(xué)和 貝類 遺傳育種學(xué)基礎(chǔ)研究和技術(shù) 研 發(fā) 團(tuán)隊(duì)，培育出一批在國(guó)際上有影響的學(xué)術(shù)帶頭人，凝練了一支有很好合作基礎(chǔ)、高素質(zhì)、強(qiáng)創(chuàng)新能力的研究團(tuán)隊(duì)。 主要的技術(shù)方法 ： 貝類基因組的比較與功能基因批量發(fā)掘 利用傳統(tǒng) Sanger 技術(shù)和第二代測(cè)序技術(shù)，并結(jié)合物理圖譜和 BAC 文庫(kù)末端測(cè)序，對(duì) 基因組序列進(jìn)行 組裝和拼接，構(gòu)建牡蠣全基因組精細(xì)圖譜；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用 Genscan、 GO 和 KEGG 等工具進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和注釋；采用 Blast、PAML、 KaKs_Calculator 等工具，比較牡蠣、扇貝 和 珍珠貝基因組序列，篩選出重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的批量功能基 因。 取得一批國(guó)際一流成果，造就一批學(xué)科領(lǐng)軍人才，凝煉一支具高度創(chuàng)新能力的研究團(tuán)隊(duì)。 貝類基因組結(jié) 構(gòu)與特征 基因組信息是解析經(jīng)濟(jì)性狀和實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)。 主要研究?jī)?nèi)容： 魚(yú)類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息整合技術(shù)研究； 魚(yú)類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位、同線性和性狀關(guān)聯(lián)性研究； 魚(yú)類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組分析以及在群體和家系中的功能研究； 魚(yú)類主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)與育種效率評(píng)估研究； 可用于魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合技術(shù)研究。 （四）、可行性分析： 1) 厚實(shí)的前期研究基礎(chǔ)，目標(biāo)明確： 魚(yú)類等水產(chǎn)動(dòng)物的分子設(shè)計(jì)育種研究雖然還處于起步階段，但可喜的是，隨著斑馬魚(yú)、河 鲀 和青 鳉 等模式魚(yú)類全基因組測(cè)序的完成和基因功能研究的不斷深入，一些重要養(yǎng)殖魚(yú)類的功能基因組研究已進(jìn)展很快，特別是我們這個(gè)團(tuán)隊(duì)在上一期 973 計(jì)劃 “ 重要魚(yú) 類品種改良的遺傳和發(fā)育基礎(chǔ)研究 ” 的支持下，已篩選鑒定出一批與我國(guó)主要養(yǎng)殖魚(yú)類的生殖、生長(zhǎng)、抗性等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因和分子標(biāo)記，建立了 10 多個(gè)養(yǎng)殖魚(yú)類細(xì)胞系， 積累了 厚實(shí)的前期研究基礎(chǔ)。 2） 魚(yú)類生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降、整體原位雜交、細(xì)胞示蹤、免疫熒光定位以及組織碎片灌流和細(xì)胞孵育等在體和離體研究等技術(shù)，重點(diǎn)解析魚(yú)類下丘腦/垂體控制生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚(yú)類性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；探討腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及其對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚(yú)類肌肉細(xì)胞增殖和魚(yú)肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系；闡明魚(yú)類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開(kāi)拓生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基因用于魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 技術(shù)途徑的示意圖如下： 細(xì)胞示蹤等研究細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)方法、胚胎細(xì)胞移植等 體外孵育或灌流結(jié)合放射性免疫測(cè)定研究生理功能 DNA 甲基化分析 啟動(dòng)子分析 morpholino 介導(dǎo)、 siRNA 干擾等基因敲降方法 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除 模式魚(yú)類（斑馬魚(yú)、青 鳉 、河豚、三棘刺魚(yú) 等 ）全基因組信息 前期 已獲得 的 大量與魚(yú)類生殖、生長(zhǎng)和抗性相關(guān)基因資源 已建立 的大批魚(yú)類細(xì)胞系 魚(yú)類生殖、生長(zhǎng)和抗性的主控基因和分子標(biāo)記的功能揭示和作用機(jī)理闡明 比較轉(zhuǎn)錄基因組分析 Western、免疫組化、 WISH 等研究時(shí)空表達(dá)譜等方法 CoIP、 GSTpull down、 FRAP、 FRET、BiFC 等研究蛋白相互作用方法 ChIP、 EMSA 等研究核酸與蛋白相互作用等方法 FACS、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)泛素化、乙?；刃揎椃治? 魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種數(shù)量性狀多基因聚合技術(shù) 魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù) 多基因信息整合 性狀的 QTL 與 eQTL 分析 基因同線性與性狀關(guān)聯(lián)性分析 蛋白分子設(shè)計(jì)、 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除方法、 BAC 或Tol2 轉(zhuǎn)座子、 Cre/lox、 PGC 操作、miRNA和 piRNAs 調(diào)控 魚(yú)類生殖、生長(zhǎng)和抗性 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析 魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種的策略和可行性途徑 （三）、創(chuàng)新點(diǎn)與特色： 1) 重要的研究對(duì)象，體現(xiàn)了國(guó)家重大需求導(dǎo)向： 本項(xiàng)目以我國(guó)重要養(yǎng)殖魚(yú)類鯽、鯉等為主要研究對(duì)象，圍繞水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新所要解決的魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種 的策略和理論基礎(chǔ)以及魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展研究，著眼于解決國(guó)家中長(zhǎng)期發(fā)展中所需要解決的重大科學(xué)問(wèn)題，體現(xiàn)了重大的國(guó)家需求導(dǎo)向。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所、中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 課題負(fù)責(zé)人 ： 廖小林 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 陳松林 張義 兵 、 朱蓉、袁秀平、沙珍霞 、 田永勝、王娜 、 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 4 魚(yú)類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚(yú)類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；揭示低溫脅迫下不耐寒魚(yú)類基因表達(dá)譜與耐寒魚(yú)類基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；闡明魚(yú)類耐寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；創(chuàng)制魚(yú)類抗寒機(jī)理研究模型，開(kāi)拓魚(yú)類抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 1. 重點(diǎn)闡明 23 個(gè)重要功能基因在殖質(zhì)的形成和遷移、卵子成熟、卵胚轉(zhuǎn)換和性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 獲得 35 個(gè)重要的通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)軸因子和育性調(diào)控的轉(zhuǎn)基因養(yǎng)殖或模式魚(yú)品系，用以開(kāi)展個(gè)體促生長(zhǎng)、改善肉質(zhì)等經(jīng)濟(jì)性狀改良的研究平臺(tái)； 3. 闡明 23 個(gè)重要基因在病毒感染識(shí)別以及抗病毒信號(hào)傳遞中的作用機(jī)理；闡明 23 個(gè)重要基因在細(xì)菌感染識(shí)別等信號(hào)傳遞中的作用機(jī)理； 5. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計(jì)育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個(gè)在生殖、生長(zhǎng) 或抗性等目標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 路線和策略； 7. 建立優(yōu)化和完善的基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚(yú)類基因快速敲除系統(tǒng)； 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 8. 穩(wěn)定遺傳、快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長(zhǎng)激素受體基因魚(yú)家系的建立 ，創(chuàng)制原生殖細(xì)胞操作技術(shù)和可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚(yú)模型 ， 闡明小RNA 分子在性分化過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)理。 構(gòu)建牡蠣的基因組精細(xì)圖譜，比較扇貝、珍珠貝和牡蠣的基因組差異；獲得批量 牡蠣、扇貝和珍珠貝功能基因和 SNP 標(biāo)記；構(gòu)建高密度遺傳圖譜。 現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)為本項(xiàng)目研究提供了強(qiáng)有力的工具。 項(xiàng)目組在貝類遺傳育種領(lǐng)域具有堅(jiān)實(shí)的研究積累 在國(guó)家 863 計(jì)劃、自然科學(xué)基金項(xiàng)目、支撐計(jì)劃等有關(guān)項(xiàng)目的支撐下，項(xiàng)目組在牡蠣等貝類的遺傳育種基礎(chǔ)理論研究和材料體系建設(shè) 方面 已取得豐碩成果，培育出 多 個(gè) 水產(chǎn)養(yǎng)殖 新品種 （系） 。 3）構(gòu)建貝類基因組數(shù)據(jù)庫(kù) ：可在線查詢貝類基因組序列、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、注釋基因、 SNP 及其定位信息、基因家族的基因拷貝數(shù)及分布，并提供同源比對(duì)等服務(wù)功能。 研究?jī)?nèi)容： 1）抗病相關(guān)功能基因與表型相關(guān)關(guān)系、作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)理 ：通過(guò)全基因組序列確定的抗病 /免疫相關(guān)基因，研究候選基因多態(tài)性，篩查 SNP 等 分子標(biāo)記；利用特定抗病的貝類樣本材料，采用連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等技術(shù)方法，開(kāi)展 QTL 定位，確定貝類抗性候選功能基因與抗性性狀相關(guān)關(guān)系，進(jìn)行功能驗(yàn)證，分析研究其表達(dá)特征和作用機(jī)理，解析、闡明相關(guān)基因在抗性相關(guān)過(guò)程的調(diào)控規(guī)律和網(wǎng)絡(luò)途徑。 （ 2） 篩查 、分析和克隆與貝類 生長(zhǎng)發(fā)育 、抗 性性狀、 珍珠質(zhì)形成 相關(guān)基因， 構(gòu)建適合 QTL 定位和 SNP 多態(tài)性分子標(biāo)記功能分析的遺傳材料 、篩選模型。 （ 2） 篩選 生長(zhǎng)發(fā)育等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的功能基因、 挖掘候選基因的SNP。 2）珍珠質(zhì)形成相關(guān)基因與珍珠質(zhì)量的相關(guān)性 ：從珍珠質(zhì)形成相關(guān)基因中發(fā)掘 SNP 標(biāo)記，確定等位基因型；分析 SNP 標(biāo)記基因型對(duì)珍珠珠層厚度和珍珠顏色的遺傳效應(yīng)，確定功能 SNP 基因型與珍珠質(zhì)量有關(guān)性狀的連鎖關(guān)系。 研究?jī)?nèi)容： 1）貝類 SNP 的規(guī)模發(fā)掘 利用牡蠣 等貝類 基因組序列信息， 以 SOAP 等軟件 大規(guī)模篩選 SNP，利用各種不同通量的 SNP 分型技術(shù)開(kāi)發(fā) SNP 標(biāo)記。項(xiàng)目建議的首席科學(xué)家與美、法等國(guó)科學(xué)家合作，領(lǐng)導(dǎo)了 “牡蠣基因組計(jì)劃（ OGP） ”研究。 貝類抗病和抗逆的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制 利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法，基于牡蠣等全基因組序列信息篩查抗性相關(guān)候選基因；利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組技術(shù)、 RNA 干擾、 DNA 重組技術(shù)等鑒定主效基因，研究基因功能，建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控模型、表達(dá)特征和作用機(jī)理；應(yīng)用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，開(kāi)展抗性相關(guān)的 QTL 定位，確定牡 蠣等經(jīng)濟(jì)貝類抗性候選功能基因與抗性性狀相關(guān)關(guān)系，并確定基因型和表型的關(guān)系。 良種分子設(shè)計(jì)理論和技術(shù)基礎(chǔ)研究 構(gòu)建 23 個(gè)主要育種性狀的 GP 模型； 實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)和抗逆性狀的復(fù)合 /聚合育種，研發(fā)出計(jì)算機(jī)模擬育種技術(shù)， 構(gòu)建育種模擬技術(shù)平臺(tái)并進(jìn)行育種驗(yàn)證，輔助應(yīng)用于新品種的培育。 重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析 貝類生長(zhǎng)、發(fā)育、抗性和珍珠質(zhì)形成等是貝類 重要或特有的經(jīng)濟(jì)性狀，以功能基因組學(xué)為基礎(chǔ)，篩選上述性狀的關(guān)鍵基因，研究和驗(yàn)證基因的功能和調(diào)控機(jī)制，闡明基因?qū)π誀畹臎Q定機(jī)制，解析主要性狀基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為分子設(shè)計(jì)育種奠定理論基礎(chǔ)。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、武漢大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 孫永華 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 肖武漢 、 劉靜霞 、 程漢華 、 王燕舞 、 羅大極 、 劉江東 、 曹宏 經(jīng)費(fèi)比例： 17% 四、年度計(jì)劃 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 重要養(yǎng)殖魚(yú)類基因組 BAC 文庫(kù)構(gòu)建以及與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚(yú)類與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 抑肌素信號(hào)表達(dá)水平改變對(duì)魚(yú)體肌肉生長(zhǎng)的調(diào)控研 究； 4. 細(xì)菌病和病毒性疾病抗性群體和易感群體的篩選和建立； 5. 抗寒候選基因 的 轉(zhuǎn)基因操作研究 ； 6. 鯉魚(yú) QTL 分析家系的建立及其多態(tài)性微衛(wèi)星和 SNP 等遺傳標(biāo)記的發(fā)掘篩選和驗(yàn)證； 7. 魚(yú)類生長(zhǎng)和抗病等經(jīng)濟(jì)性狀 QTL和主效基因的信息收集與分析整合； 8. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn) 和 基因敲除載體系統(tǒng) 的改造 ； 9. 持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的分子設(shè)計(jì) ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的鑒定 ，小 RNA 的分離、克隆 和 深度測(cè)序。 3) 堅(jiān)實(shí)、完善的研究基地，支撐有力： 本項(xiàng)目利用淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、有害生物控制和資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)部門(mén)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室研究基地的研究條件，這些實(shí)驗(yàn)室擁有完善的一流研究設(shè)備，先進(jìn)的研究條件，是順利完成本項(xiàng)目的堅(jiān)實(shí)支撐和重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 4）魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過(guò)建立魚(yú)類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚(yú)類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚(yú)類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚(yú)類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們?cè)谌后w和家系中的功能，確定魚(yú)類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記和基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin immunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術(shù)研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GST