【正文】 （ 2） 篩選出貝類生長發(fā)育相關(guān)基因70 個 、抗病功能基因 1015 個、 與貝類珍珠質(zhì)形成相關(guān)的功能基因510 個 ，建立家系等遺傳育種材料。 功能基因驗證 ：明確 35 個功能基因與珍珠質(zhì)量的相關(guān)性，闡明其表達(dá)調(diào)控規(guī)律及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；確定 45種基質(zhì)蛋白在珍珠質(zhì)形成過程中的調(diào)控作用。 2）牡蠣全基因組注釋及功能基因的規(guī)模開發(fā) ：借助生物信息學(xué)分析軟件，對全基因組圖譜進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)分析、基因功能注釋 與 分類，開展轉(zhuǎn)錄組研究，豐富已有的 EST 和 cDNA 資源，規(guī)模開發(fā)功能基因。 已建成一支高素質(zhì)的研究團(tuán)隊 經(jīng)過國家多年的連續(xù)支持，在國內(nèi)已經(jīng)形成以中國科學(xué)院海洋研究所、中國海洋大學(xué)、廈門大學(xué)、中國科學(xué)院南海海洋所 、 清華大學(xué) 、海南大學(xué)、深圳華大基 因研究院 等單位為主的基因組學(xué) 、生物信息學(xué)和 貝類 遺傳育種學(xué)基礎(chǔ)研究和技術(shù) 研 發(fā) 團(tuán)隊，培育出一批在國際上有影響的學(xué)術(shù)帶頭人，凝練了一支有很好合作基礎(chǔ)、高素質(zhì)、強(qiáng)創(chuàng)新能力的研究團(tuán)隊。 主要的技術(shù)方法 ： 貝類基因組的比較與功能基因批量發(fā)掘 利用傳統(tǒng) Sanger 技術(shù)和第二代測序技術(shù)，并結(jié)合物理圖譜和 BAC 文庫末端測序，對 基因組序列進(jìn)行 組裝和拼接，構(gòu)建牡蠣全基因組精細(xì)圖譜；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序，利用 Genscan、 GO 和 KEGG 等工具進(jìn)行基因預(yù)測和注釋；采用 Blast、PAML、 KaKs_Calculator 等工具，比較牡蠣、扇貝 和 珍珠貝基因組序列，篩選出重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的批量功能基 因。 取得一批國際一流成果，造就一批學(xué)科領(lǐng)軍人才，凝煉一支具高度創(chuàng)新能力的研究團(tuán)隊。 貝類基因組結(jié) 構(gòu)與特征 基因組信息是解析經(jīng)濟(jì)性狀和實現(xiàn)分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)。 主要研究內(nèi)容： 魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息整合技術(shù)研究； 魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位、同線性和性狀關(guān)聯(lián)性研究； 魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組分析以及在群體和家系中的功能研究； 魚類主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)與育種效率評估研究； 可用于魚類分子設(shè)計育種的多基因聚合技術(shù)研究。 （四）、可行性分析： 1) 厚實的前期研究基礎(chǔ)，目標(biāo)明確： 魚類等水產(chǎn)動物的分子設(shè)計育種研究雖然還處于起步階段，但可喜的是，隨著斑馬魚、河 鲀 和青 鳉 等模式魚類全基因組測序的完成和基因功能研究的不斷深入，一些重要養(yǎng)殖魚類的功能基因組研究已進(jìn)展很快，特別是我們這個團(tuán)隊在上一期 973 計劃 “ 重要魚 類品種改良的遺傳和發(fā)育基礎(chǔ)研究 ” 的支持下，已篩選鑒定出一批與我國主要養(yǎng)殖魚類的生殖、生長、抗性等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因和分子標(biāo)記，建立了 10 多個養(yǎng)殖魚類細(xì)胞系， 積累了 厚實的前期研究基礎(chǔ)。 2） 魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 采用 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降、整體原位雜交、細(xì)胞示蹤、免疫熒光定位以及組織碎片灌流和細(xì)胞孵育等在體和離體研究等技術(shù)，重點解析魚類下丘腦/垂體控制生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；探討腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路及其對魚類生長的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚類肌肉細(xì)胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系；闡明魚類個體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開拓生長基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基因用于魚類分子設(shè)計育種的可行性途徑。 技術(shù)途徑的示意圖如下： 細(xì)胞示蹤等研究細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)方法、胚胎細(xì)胞移植等 體外孵育或灌流結(jié)合放射性免疫測定研究生理功能 DNA 甲基化分析 啟動子分析 morpholino 介導(dǎo)、 siRNA 干擾等基因敲降方法 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除 模式魚類（斑馬魚、青 鳉 、河豚、三棘刺魚 等 ）全基因組信息 前期 已獲得 的 大量與魚類生殖、生長和抗性相關(guān)基因資源 已建立 的大批魚類細(xì)胞系 魚類生殖、生長和抗性的主控基因和分子標(biāo)記的功能揭示和作用機(jī)理闡明 比較轉(zhuǎn)錄基因組分析 Western、免疫組化、 WISH 等研究時空表達(dá)譜等方法 CoIP、 GSTpull down、 FRAP、 FRET、BiFC 等研究蛋白相互作用方法 ChIP、 EMSA 等研究核酸與蛋白相互作用等方法 FACS、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)泛素化、乙?；刃揎椃治? 魚類分子設(shè)計育種數(shù)量性狀多基因聚合技術(shù) 魚類分子設(shè)計育種的基因操作技術(shù) 多基因信息整合 性狀的 QTL 與 eQTL 分析 基因同線性與性狀關(guān)聯(lián)性分析 蛋白分子設(shè)計、 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除方法、 BAC 或Tol2 轉(zhuǎn)座子、 Cre/lox、 PGC 操作、miRNA和 piRNAs 調(diào)控 魚類生殖、生長和抗性 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析 魚類分子設(shè)計育種的策略和可行性途徑 （三）、創(chuàng)新點與特色： 1) 重要的研究對象，體現(xiàn)了國家重大需求導(dǎo)向： 本項目以我國重要養(yǎng)殖魚類鯽、鯉等為主要研究對象，圍繞水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新所要解決的魚類分子設(shè)計育種 的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計育種的 可行性途徑這兩個 關(guān)鍵科學(xué)問題開展研究，著眼于解決國家中長期發(fā)展中所需要解決的重大科學(xué)問題，體現(xiàn)了重大的國家需求導(dǎo)向。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所、中國科學(xué)院水生生物研究所 課題負(fù)責(zé)人 ： 廖小林 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 陳松林 張義 兵 、 朱蓉、袁秀平、沙珍霞 、 田永勝、王娜 、 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 4 魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達(dá)譜與耐寒魚類基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；闡明魚類耐寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；創(chuàng)制魚類抗寒機(jī)理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設(shè)計育種的可行性途徑。 1. 重點闡明 23 個重要功能基因在殖質(zhì)的形成和遷移、卵子成熟、卵胚轉(zhuǎn)換和性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 獲得 35 個重要的通過調(diào)控生長軸因子和育性調(diào)控的轉(zhuǎn)基因養(yǎng)殖或模式魚品系，用以開展個體促生長、改善肉質(zhì)等經(jīng)濟(jì)性狀改良的研究平臺； 3. 闡明 23 個重要基因在病毒感染識別以及抗病毒信號傳遞中的作用機(jī)理；闡明 23 個重要基因在細(xì)菌感染識別等信號傳遞中的作用機(jī)理； 5. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個在生殖、生長 或抗性等目標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 路線和策略； 7. 建立優(yōu)化和完善的基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)； 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 8. 穩(wěn)定遺傳、快速生長的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長激素受體基因魚家系的建立 ，創(chuàng)制原生殖細(xì)胞操作技術(shù)和可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚模型 ， 闡明小RNA 分子在性分化過程的分子調(diào)控機(jī)理。 構(gòu)建牡蠣的基因組精細(xì)圖譜，比較扇貝、珍珠貝和牡蠣的基因組差異；獲得批量 牡蠣、扇貝和珍珠貝功能基因和 SNP 標(biāo)記；構(gòu)建高密度遺傳圖譜。 現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)為本項目研究提供了強(qiáng)有力的工具。 項目組在貝類遺傳育種領(lǐng)域具有堅實的研究積累 在國家 863 計劃、自然科學(xué)基金項目、支撐計劃等有關(guān)項目的支撐下，項目組在牡蠣等貝類的遺傳育種基礎(chǔ)理論研究和材料體系建設(shè) 方面 已取得豐碩成果，培育出 多 個 水產(chǎn)養(yǎng)殖 新品種 （系） 。 3）構(gòu)建貝類基因組數(shù)據(jù)庫 ：可在線查詢貝類基因組序列、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、注釋基因、 SNP 及其定位信息、基因家族的基因拷貝數(shù)及分布，并提供同源比對等服務(wù)功能。 研究內(nèi)容： 1）抗病相關(guān)功能基因與表型相關(guān)關(guān)系、作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)理 ：通過全基因組序列確定的抗病 /免疫相關(guān)基因，研究候選基因多態(tài)性，篩查 SNP 等 分子標(biāo)記；利用特定抗病的貝類樣本材料，采用連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等技術(shù)方法，開展 QTL 定位，確定貝類抗性候選功能基因與抗性性狀相關(guān)關(guān)系，進(jìn)行功能驗證，分析研究其表達(dá)特征和作用機(jī)理，解析、闡明相關(guān)基因在抗性相關(guān)過程的調(diào)控規(guī)律和網(wǎng)絡(luò)途徑。 （ 2） 篩查 、分析和克隆與貝類 生長發(fā)育 、抗 性性狀、 珍珠質(zhì)形成 相關(guān)基因， 構(gòu)建適合 QTL 定位和 SNP 多態(tài)性分子標(biāo)記功能分析的遺傳材料 、篩選模型。 （ 2） 篩選 生長發(fā)育等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的功能基因、 挖掘候選基因的SNP。 2）珍珠質(zhì)形成相關(guān)基因與珍珠質(zhì)量的相關(guān)性 ：從珍珠質(zhì)形成相關(guān)基因中發(fā)掘 SNP 標(biāo)記，確定等位基因型；分析 SNP 標(biāo)記基因型對珍珠珠層厚度和珍珠顏色的遺傳效應(yīng)，確定功能 SNP 基因型與珍珠質(zhì)量有關(guān)性狀的連鎖關(guān)系。 研究內(nèi)容： 1）貝類 SNP 的規(guī)模發(fā)掘 利用牡蠣 等貝類 基因組序列信息， 以 SOAP 等軟件 大規(guī)模篩選 SNP，利用各種不同通量的 SNP 分型技術(shù)開發(fā) SNP 標(biāo)記。項目建議的首席科學(xué)家與美、法等國科學(xué)家合作，領(lǐng)導(dǎo)了 “牡蠣基因組計劃（ OGP） ”研究。 貝類抗病和抗逆的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制 利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法，基于牡蠣等全基因組序列信息篩查抗性相關(guān)候選基因；利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組技術(shù)、 RNA 干擾、 DNA 重組技術(shù)等鑒定主效基因，研究基因功能，建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控模型、表達(dá)特征和作用機(jī)理；應(yīng)用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，開展抗性相關(guān)的 QTL 定位，確定牡 蠣等經(jīng)濟(jì)貝類抗性候選功能基因與抗性性狀相關(guān)關(guān)系，并確定基因型和表型的關(guān)系。 良種分子設(shè)計理論和技術(shù)基礎(chǔ)研究 構(gòu)建 23 個主要育種性狀的 GP 模型； 實現(xiàn)生長和抗逆性狀的復(fù)合 /聚合育種，研發(fā)出計算機(jī)模擬育種技術(shù)， 構(gòu)建育種模擬技術(shù)平臺并進(jìn)行育種驗證，輔助應(yīng)用于新品種的培育。 重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析 貝類生長、發(fā)育、抗性和珍珠質(zhì)形成等是貝類 重要或特有的經(jīng)濟(jì)性狀，以功能基因組學(xué)為基礎(chǔ)，篩選上述性狀的關(guān)鍵基因，研究和驗證基因的功能和調(diào)控機(jī)制，闡明基因?qū)π誀畹臎Q定機(jī)制，解析主要性狀基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為分子設(shè)計育種奠定理論基礎(chǔ)。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國科學(xué)院水生生物研究所、武漢大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 孫永華 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 肖武漢 、 劉靜霞 、 程漢華 、 王燕舞 、 羅大極 、 劉江東 、 曹宏 經(jīng)費(fèi)比例： 17% 四、年度計劃 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫構(gòu)建以及與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 抑肌素信號表達(dá)水平改變對魚體肌肉生長的調(diào)控研 究； 4. 細(xì)菌病和病毒性疾病抗性群體和易感群體的篩選和建立； 5. 抗寒候選基因 的 轉(zhuǎn)基因操作研究 ； 6. 鯉魚 QTL 分析家系的建立及其多態(tài)性微衛(wèi)星和 SNP 等遺傳標(biāo)記的發(fā)掘篩選和驗證； 7. 魚類生長和抗病等經(jīng)濟(jì)性狀 QTL和主效基因的信息收集與分析整合； 8. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因試驗 和 基因敲除載體系統(tǒng) 的改造 ； 9. 持續(xù)激活的生長激素受體基因的分子設(shè)計 ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的鑒定 ，小 RNA 的分離、克隆 和 深度測序。 3) 堅實、完善的研究基地，支撐有力： 本項目利用淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室、有害生物控制和資源利用國家重點實驗室和多個部門重點開放實驗室研究基地的研究條件，這些實驗室擁有完善的一流研究設(shè)備，先進(jìn)的研究條件，是順利完成本項目的堅實支撐和重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 4）魚類分子設(shè)計育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們在群體和家系中的功能，確定魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記和基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin immunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術(shù)研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GST