【正文】 pull down、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、雙分子熒光互補(bǔ)（ bimolecular fluorescence plementation， BiFC）等技術(shù)研究蛋白相互作用； 對(duì)一些重要蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析、并對(duì)其進(jìn)行泛素化、乙?；土姿峄刃揎椃治?； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚三倍體卵子中相關(guān)同源基因啟動(dòng)子 CpG 島甲基化差異和基因表達(dá)調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標(biāo)基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動(dòng)子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、浙江大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 桂建芳 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 周莉、羅琛、汪洋、鄭康、李忠、李志、魏麗華 經(jīng)費(fèi)比例： 25% 課題 2 魚類生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類下丘腦 /垂體控制生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；闡明腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及其對(duì)魚類生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚類肌肉細(xì)胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制出可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系；闡明魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開拓生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基 因用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 第 四 年 1. 魚類生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒的重要基因 的 功能分析； 2. 重要功能基因的啟動(dòng)子分析； 3. 重要功能基因的信號(hào)傳遞及其調(diào)控機(jī)制研究； 4. 魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用 研究； 5. 雌核發(fā)育和近交家系中抗病性狀與抗病分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性分析及QTL 定位； 6. 建立多基因聚合的轉(zhuǎn)羅非魚載體，獲得轉(zhuǎn)基因子一代 ； 7. 繼續(xù)遺傳圖譜構(gòu)建及其品系或不同作圖群體間的雜交、回交分析與測(cè)量； 8. 原生質(zhì) 細(xì)胞操作相關(guān)的基因操作載體設(shè)計(jì) ， 基因敲除純合體 的獲得 ； 9. 轉(zhuǎn)基因魚 F2 代的獲得和擴(kuò)群 ， 不同轉(zhuǎn)基因 F2 代家系的生長(zhǎng)比較和信號(hào)通路活性比較 ， 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)干1. 鑒定調(diào)控魚類生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒的功能基因或分子標(biāo)記 410個(gè)； 23個(gè)重要基因在生殖質(zhì) 的形成和遷移、卵母細(xì)胞成熟、卵胚轉(zhuǎn)換以及性別決定和分化中的 功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ； 3. 揭示 23 個(gè)重要基因在魚類生長(zhǎng)中的功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 4. 揭示 23 個(gè)抗病關(guān)鍵基因表達(dá)產(chǎn)物在預(yù)防魚類病毒性和細(xì)菌性疾病中的作用及其機(jī)理；闡明抗病候選功能基因和分子標(biāo)記與魚類抗病性狀的關(guān)系； 5. 闡明 13 個(gè)重要病原基因的生物學(xué)功能及其免疫原性； 6. 獲得能提高斑馬魚和羅非魚抗寒性能的多基因聚合體 ； 7. 獲得 MAPPING 標(biāo)記 500 個(gè)以上；年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 擾原生殖細(xì)胞的正常發(fā)育 ， 小 RNA及其互作蛋白與靶基因的作用研究。定位目標(biāo)性狀基因 /QTL，明確基因型與表型關(guān)系。 通過牡蠣全基因組序列及其與扇貝、珍珠貝基因組的比較研究， 全面了解貝類基因組結(jié)構(gòu)與特征；在基因組水平大規(guī)模開發(fā)功能基因和 SNP 等標(biāo)記，明確生長(zhǎng)、發(fā)育、抗性和珍珠質(zhì)形成等重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵基因、作用機(jī)理和途徑，為剖析重要性狀的分子調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。在貝類已有的工作基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目借鑒種植業(yè)、畜牧業(yè)已取得的成功經(jīng)驗(yàn)，發(fā)揮貝類育種的材料優(yōu)勢(shì)，能確保實(shí)現(xiàn)項(xiàng)目的預(yù)期目標(biāo)。六個(gè)課題的設(shè)置以及與科學(xué)問題的對(duì)應(yīng)關(guān)系見圖 2。 3）生長(zhǎng)發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ：利用貝類特定耐性材料，研究生長(zhǎng)相關(guān)基因與環(huán)境的互作；采用 RNAi、噬菌體展示和酵母雙雜交等技術(shù)，研究貝類發(fā)育尤其是幼蟲變態(tài)和原生殼形成相關(guān)功能基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 闡明其表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 3） 模擬與驗(yàn)證： 實(shí)現(xiàn)模擬育種與實(shí)際分子育種的相互促進(jìn)和驗(yàn)證，建立貝類分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)平臺(tái)。 （ 2） 分析鑒定 一批與 貝類生長(zhǎng)發(fā)育 、抗性性狀 、 貝類珍珠質(zhì)形成相關(guān) 基因，獲得 SNP 分子標(biāo)記 、初步了解相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)控模式 。 經(jīng)費(fèi)比例： % 承擔(dān)單位： 清華大學(xué)、海南大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 謝莉萍 學(xué)術(shù)骨干： 顧志峰、李鵬、李玉明、 痲 彩萍、石耀華、王愛民、王嫣、張貴 友 課題 貝類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 預(yù)期目標(biāo)： 1）主要性狀 GP模型 ：構(gòu)建 23個(gè)主要育種性狀的 GP 模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)； 2）育種模擬技術(shù)平臺(tái) ：完成育種模擬技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建，能夠?qū)?shí)際育種過程的親本選配和后代選擇提供參考，輔助應(yīng)用于 12個(gè)新品種培育，檢測(cè)分子設(shè)計(jì)育種的策略和可行性。 2）功能基因 鑒定 ： 明確 1520 個(gè) 關(guān)鍵基因 在貝類 生長(zhǎng)發(fā)育 中的作用 ，提出2 個(gè)生長(zhǎng)和變態(tài)基因調(diào)控模型；篩查 35 個(gè)功能 SNP 多態(tài)分子標(biāo)記，明確其對(duì)性狀的遺傳效應(yīng)，建立基因型與表型的關(guān)系。圍繞生長(zhǎng)發(fā)育， 抗性和珍珠質(zhì)形成 等重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析，設(shè)置了 3 個(gè)課題，以 篩選和驗(yàn)證 重要性狀 的關(guān)鍵基因，研究其作用機(jī)理和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，定位目標(biāo)性狀基因 /QTL，明確基因型與表型關(guān) 系 。 （三）創(chuàng)新點(diǎn)與特色 對(duì) 貝類基因組結(jié)構(gòu) 與特征得到全新認(rèn)識(shí) 率先建立 全基因組序列 圖譜，解析牡蠣等貝類基因組結(jié)構(gòu)與特征，規(guī)模發(fā)掘功能基因和 SNP 標(biāo)記，構(gòu)建高密度遺傳圖譜。 三、研究方案 （一）學(xué)術(shù)思路 本項(xiàng)目 針 對(duì)我國(guó) 海水養(yǎng)殖 業(yè)良種缺乏，遺傳育種基礎(chǔ)理論 薄弱 的現(xiàn)狀，凝練出貝類基因組 的 結(jié)構(gòu)與特征、重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子 解析 和分子設(shè)計(jì) 育種的技術(shù)途徑 等重大科學(xué)問題。本關(guān)鍵科學(xué)問題包含 4 個(gè)重 要內(nèi)涵： ① 基因、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)環(huán)境的反應(yīng)； ② 育種性狀的 GP鏈接模型和數(shù)據(jù)庫(kù)； ③ 生長(zhǎng)和抗性性狀的復(fù)合 /聚合； ④ 模擬育種平臺(tái)與育種驗(yàn)證。 1. 鑒定調(diào)控魚類生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒的功能基因或分子標(biāo)記 1015個(gè)； 2. 揭示差異順式調(diào)控序列與 相關(guān)基因啟動(dòng)子差異甲基化修飾的關(guān)系及其功能特征； 3. 構(gòu)建可控性性腺發(fā)育抑制轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定遺傳品系； 4. 完成對(duì)養(yǎng)殖魚類肌肉組織中抑制抑肌素功能受阻的 F0個(gè)體篩選，并對(duì)其進(jìn)行肌肉生長(zhǎng)性狀特征的初步觀察； 5. 獲得構(gòu)建牙鲆抗病性狀關(guān)聯(lián)分析基礎(chǔ)群體和 QTL作圖群體； 6. 獲得 3 個(gè)抗寒基因的 轉(zhuǎn)基因斑馬魚 F1 代 ； 獲得 5 個(gè)抗寒基因的 轉(zhuǎn)基因羅非魚 F0 代。 項(xiàng)目的主要研究?jī)?nèi)容、課題設(shè)置和課題間的聯(lián)系 與項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和總體目標(biāo)的 學(xué)術(shù)思路圖 項(xiàng)目設(shè)置的 6 個(gè)課題是： 課題 1 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究； 課題 2 魚類生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究； 課題 3 魚類抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究； 課題 4 魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究； 課題 5 魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)研究； 魚類主要經(jīng)濟(jì)性狀的功能基因組 魚類生殖功能基因組 魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ) 魚類生長(zhǎng)功能基因組 魚類抗性功能基因組 主要研究?jī)?nèi)容 解決的關(guān)鍵科學(xué)問題 總體目標(biāo) 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 魚類生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的 基礎(chǔ)研究 魚類抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的 基礎(chǔ)研究 魚類 抗寒基因 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的 基礎(chǔ)研究 課題設(shè)置的 思 路 魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)研究 魚類數(shù)量性狀多基因聚合 育種 技術(shù)研究 魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑 魚類分子設(shè)計(jì)育種的實(shí)踐與應(yīng)用 課題 6 魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)研究。通過這些研究，使我國(guó)在魚類功能基因組研究中居國(guó)際領(lǐng)先水平，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖新品種奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)，為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 解析魚類生殖、 生長(zhǎng)、抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 篩選鑒定 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、 可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的功能基因和分子標(biāo)記 30－ 50 個(gè) ； 3. 揭示魚類性別決定與分化、卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制； 4. 闡明魚類生長(zhǎng)激素分泌的信號(hào)通路； 5. 闡明魚類 干擾素系統(tǒng)關(guān)鍵基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用機(jī)理；闡明魚類抗寒關(guān)鍵信號(hào)通路及其作用機(jī)理； 6. 建立魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)； 7. 創(chuàng)建基于蛋白分子設(shè)計(jì)和遺傳安全的穩(wěn)定高效的基因操作技術(shù)； 8. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計(jì)育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個(gè)在生殖、生長(zhǎng) 或抗性等目 標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 9. 凝聚和 培養(yǎng)一批有國(guó)際影響的中青年學(xué)術(shù)帶頭人 和學(xué)術(shù)骨干 ；發(fā)表一批高質(zhì)量的學(xué)術(shù)論文，其中在有重要國(guó)際影響的期刊（ 相關(guān)領(lǐng)域引用排名前 15%的期刊或影響因子大于 5 的期刊）發(fā)表論文50 篇以上。 以下將具體說明各課題的主要研究目標(biāo)、主要研究?jī)?nèi)容、承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé) 人及主要學(xué)術(shù)骨干和經(jīng)費(fèi)比例等。 7. MAPPING 到圖譜上 300個(gè)標(biāo)記以上；建立后備親魚的核心群體 100尾以上；圖譜定位 QTL1020個(gè)，獲得基因同線性分析的結(jié)果； 8. 獲得可用于魚類轉(zhuǎn) 基因的高效的轉(zhuǎn)座子 和 Cre/lox基因靶位操作體系 ， 獲得 EAF1等基因敲除的斑馬魚胚胎； 9. 獲得轉(zhuǎn)基因魚 P0代 ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因敲落 的胚胎和 原生殖細(xì)胞特異啟動(dòng)子系統(tǒng) ， 揭示小RNA動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，獲得相關(guān)互作蛋白。 （二）主要研究?jī)?nèi)容 基于牡蠣全基因組框架圖，比較貝類基因組結(jié)構(gòu)，規(guī)模開發(fā)貝類功能基因和SNP 標(biāo)記；構(gòu)建全基因組序列精細(xì)圖譜和高密度遺傳圖譜。選取產(chǎn)業(yè)影響大，研究基礎(chǔ)好，并已完成全基因組測(cè)序的牡蠣作為代表種類，貫穿六個(gè)課題所有的研究?jī)?nèi)容，同時(shí)選取與牡蠣近源但主要經(jīng)濟(jì)性狀有明顯差異的扇貝和珍珠貝作為研究對(duì)象，聚焦關(guān)鍵科學(xué)問題、突出重點(diǎn)，基于組學(xué)等前沿生物學(xué)技術(shù)，深入解析貝類重要經(jīng)濟(jì)性狀形成的分子基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制，探究分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。 重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵基因作用機(jī)理及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)獲得深入解析 重點(diǎn)抓住生長(zhǎng)、發(fā)育、抗 病、抗逆 和珍珠質(zhì)形成等貝類重要或特有的經(jīng)濟(jì)性狀，闡明決定性狀的關(guān)鍵基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示 有別于陸生動(dòng)物的海洋變溫動(dòng)物基因互作、基因 環(huán)境互作模式和機(jī)理。針對(duì)分子設(shè)計(jì)育種技 術(shù)途徑，設(shè)置 1 個(gè)研究課題，主要 分析基因、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)環(huán)境的反應(yīng) ， 建立 GP 鏈接模型 ， 開發(fā)生長(zhǎng)和抗性性狀的復(fù)合 /聚合技術(shù) ， 構(gòu)建模擬育種技術(shù)平臺(tái) ， 模擬育種與實(shí)際分子育種過程的 驗(yàn)證 。 3）知識(shí)產(chǎn)權(quán)和人才培養(yǎng) ：發(fā)表 SCI 論文 40 篇，其中影響因子 ? 論文 3篇，申請(qǐng)國(guó)家或國(guó)際發(fā)明專利 58 項(xiàng) ，培養(yǎng)碩士 15 名，博士 10 名，博士后 3 人。 3）知識(shí)產(chǎn)權(quán)和人才培養(yǎng) ：完成 SCI論文 40篇，其中影響因子 ? 2篇，申請(qǐng)發(fā)明專利 58項(xiàng)，培養(yǎng)博士研究生 10名，碩士研究生 12名。 （ 3） 構(gòu)建 23 個(gè)（其中扇貝 1－ 2 個(gè)，牡蠣 1－ 2 個(gè)）主要育種性狀的 GP 模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù) 。 2）模擬育種技術(shù) ：在主要育種性狀 GP 模型的基礎(chǔ)上，建立聚合主要性狀的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)鏈接模型，模擬預(yù)測(cè)各種可能基因型的表現(xiàn)型，構(gòu)建的育種模擬信息平臺(tái)；對(duì)貝類從基因到整體不同層次上，在計(jì)算機(jī)平臺(tái)上對(duì)育種程序中 的各種因素進(jìn)行模擬、篩選和優(yōu)化，提出分子設(shè)計(jì)育種策略和可行性途徑。 2）生長(zhǎng)發(fā)育基因分型和功能 SNP 標(biāo)記的篩選 ：建立性狀分離家系，研究篩選獲得的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的多態(tài)性，篩選性狀相關(guān)功能 SNP 標(biāo)記和有利等位基因。課題一、二是后面課題的基礎(chǔ)，課題三、四、五是本項(xiàng)目的重點(diǎn)，而課題六為整個(gè)項(xiàng)目的出口。 （四）可行性分析 項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)充分、技術(shù)路線可行 本項(xiàng)目所提出的研究方案及技術(shù)路線，即基于牡蠣全基因組框架圖譜已完成的基礎(chǔ)上，通過開展各有關(guān)組學(xué)研究獲得可供育種利用的大量基礎(chǔ)信息，通過開展重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析與調(diào)控機(jī)制奠定分子育種的理論基礎(chǔ)研究，進(jìn)而通過分子設(shè)計(jì)育種的技術(shù)研發(fā)實(shí)現(xiàn)良種培育的 “精準(zhǔn)化 ”。 （二）技術(shù)途徑 本項(xiàng)目將針對(duì)海水養(yǎng)殖貝類功能基因、經(jīng)濟(jì)性狀、分子設(shè)計(jì)等關(guān)鍵問題，開展海洋貝類重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析和分子設(shè)