【正文】 之間的相互作用及其分子機(jī)制。并在前期芯片篩選結(jié)果基礎(chǔ)上，對(duì)我們發(fā)現(xiàn)的新的 RA 相關(guān)小分子進(jìn)行研究，探討其對(duì)各種免疫細(xì)胞增殖和分化功能以及膠原性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的影響。在前期工作基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目利用我們獨(dú)有的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)和充足的臨床樣本來源，對(duì)不同亞型調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞在 CIA 及 RA 患者發(fā)病過程數(shù)量和功能的異常以及免疫 負(fù)調(diào)控機(jī)制、間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì) CIA 及 RA 患者 T細(xì)胞活化的抑制作用進(jìn)行了深入探討。 8. 探討一系列小分子參與 RA 自身免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)控的分子機(jī)制。 2）團(tuán)隊(duì)內(nèi)長(zhǎng)期的廣泛合作為項(xiàng)目順利進(jìn)行奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，可使各課題間的密切聯(lián)系得以實(shí)現(xiàn)。為此，本項(xiàng)目擬設(shè)置六個(gè)課題： 課題一、 RA 相關(guān)新型自身抗原鑒定及修飾特點(diǎn)研究；課題二、 RA 的自身 免疫應(yīng)答機(jī)制研究；課題三、 RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制；課題四、 RA 細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控機(jī)理研究；課題五、 RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究；課題六、 RA 干預(yù)新策略的研究。 3）修飾抗原在 HLADR4 遺傳背景下誘 發(fā)關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究。 研究?jī)?nèi)容： 在 RA 的炎癥啟動(dòng)、進(jìn)展及骨破壞過程中， Th17 等免疫細(xì)胞與滑膜細(xì)胞間的相互作用及分子調(diào)控機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。 研究?jī)?nèi)容： 遺傳是 RA 發(fā)病的重要因素之一，本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)建立了先進(jìn)的 RA 遺傳易感性研究平臺(tái)，對(duì) RA 免疫遺傳學(xué)機(jī)制的深入研究是發(fā)現(xiàn)新的基因靶標(biāo)用于臨床診斷和治療的重要途徑。 2） RANKL TNF 樣區(qū)疫苗對(duì) RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。同時(shí)進(jìn)行高通量 RA 易感 SNP 的篩選，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 RA 關(guān)聯(lián)基因。 10． 力爭(zhēng)篩選出 針對(duì) RA 相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)的特異性 siRNA。 13． 篩選 RA 易感 CNP。 10． 優(yōu)化或完善小分子化合物，獲得可選擇性調(diào)控 Treg 亞群分化的系列最佳娃兒藤堿類小分子化合物。 10． 分析 RA 患者外周血 Treg、 Th Th17 分布，探討 Treg 分布變化與 Th24 Th17 分布的相關(guān)性。 5． 了解不同亞群 T 細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。 4. 完成糖表位特抗體和抗 T 細(xì)胞抗體調(diào)節(jié) RAT 細(xì)胞功能的體外實(shí)驗(yàn)。 19. OPGHSP 重組蛋白的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)等的研究。 15. 評(píng)價(jià) OPGHSP 重組蛋 白的安全性、抗原性等指標(biāo)。 14. 人源化抗 Cyr61 抗體的毒理、藥代、藥動(dòng)力學(xué)及相關(guān)申報(bào)臨床研究所需制備測(cè)試與準(zhǔn)備。 4. 通過本項(xiàng)目的實(shí)施，培養(yǎng)一批能夠進(jìn)行系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究和攻關(guān)的優(yōu)秀中青年學(xué)術(shù)帶頭人和科技骨干，形成一支精干的隊(duì)伍。表觀遺傳組等 技術(shù)體系用于腫瘤或白血病研究； 基于單細(xì)胞的納米分析技術(shù)方法研究 和新型蛋白質(zhì)組相關(guān)技術(shù)并應(yīng)用于白血病研究，獲得更多結(jié)果并評(píng)價(jià)新型技術(shù)質(zhì)量和實(shí)用性； 2．在分析 10 個(gè)樣本全外顯子測(cè)序 結(jié)果基礎(chǔ)上，在較大量的樣本（ 50100 例）中進(jìn)一步評(píng)估 突變基因 頻率 ， 進(jìn)行臨床關(guān)聯(lián)分析， 為作為診斷靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)； 3．整合各種 “組 學(xué)” 分析包括有效 藥物作用 “組學(xué)”數(shù)據(jù)分析，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得 生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ；尋找和鑒定一批（ 2030）關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)分子；有選擇對(duì)一些重要功能基因、節(jié)點(diǎn)分子進(jìn)行深入研究，探討其作為藥物靶標(biāo)的可能性； 4．設(shè)計(jì)新型治療方案進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，獲得相關(guān)數(shù)據(jù)；完善新型藥物或治療方案臨床前資料，爭(zhēng)取申報(bào)新藥證書或者相關(guān)管理部門批準(zhǔn)用于臨床研究； 5．總結(jié)在 APL、 AMLM2b 和 CML 獲得各種“組學(xué)”數(shù)據(jù)，利用新理論和新技術(shù)分析和整合數(shù)據(jù)，建立初步數(shù)學(xué)模型； 38 6． 在國(guó)內(nèi)外一流學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文 610 篇，申請(qǐng)專利 35 項(xiàng)。 4． 胃癌前病變中表觀修飾調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn) 胃癌在發(fā)生過程中不僅有基因水平的變化，表觀遺傳變異是癌癥發(fā)展過程中的另一個(gè)重要事件，本課題組以往證明，癌癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化在胃癌變過程中是一個(gè)普遍現(xiàn)象，在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中有十分重要的作用，發(fā)現(xiàn)并利用這些甲基化基因有望找到更多具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵靶點(diǎn)。 36 四、年度計(jì)劃 第一年 1．建立和完善系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)平臺(tái)體系：尤其完善基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀遺傳組等系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)平臺(tái)技術(shù)，啟動(dòng)基于單細(xì)胞的納米分析技術(shù)方法研究 和新型蛋白質(zhì)組相關(guān)技術(shù)開發(fā) ； 2． APL、 AMLM2b 和 CML 患者樣本收集、完善白血病細(xì)胞模型、動(dòng)物模型以及初步建立藥物篩選技術(shù)體系和臨床評(píng)價(jià)體系； ，完成 23 個(gè) 樣本全外顯子測(cè)序，完善基因組突變分析策略和方法，力爭(zhēng)鑒定一批突變基因； 啟動(dòng) 對(duì) APL、 AMLM2b 和 CML 相應(yīng)的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型以及患者樣本進(jìn)行“組學(xué)” 分析，初步獲得一批“組學(xué)”數(shù)據(jù)，建立并完善“組學(xué)”相關(guān)生物信息分析策略和技術(shù)，評(píng)價(jià)分析策略的合理性； 4． 有效藥物作用 “組學(xué)”數(shù)據(jù) 分析： 以 AML－ M2b 細(xì)胞模型、動(dòng)物模型和患者樣本為對(duì)象，分析天然產(chǎn)物冬凌草甲素和毛萼乙素以及其衍生物對(duì) AMLM2b 細(xì)胞 作用后“組學(xué)”數(shù)據(jù)變化，獲得一批“組學(xué)”數(shù)據(jù)，并進(jìn)行初步分析； 以 CML（包括急性變）細(xì)胞模型、動(dòng)物模型和患 者樣本為對(duì)象，分析 有效藥物對(duì)“組學(xué)”數(shù)據(jù)的影響，初步獲得一批“組學(xué)”數(shù)據(jù)； 5．探討新理論和新技術(shù)分析和整合數(shù)據(jù)的可行性； 6． 在國(guó)內(nèi)外一流學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文 35 篇，申請(qǐng)專利 35 項(xiàng)。 31 32 二、預(yù)期目標(biāo) （一）總體目標(biāo)： 以我國(guó)有深厚研究積累和特色的白血病 APL和 AMLM2b亞型以及 CML為研究對(duì)象，運(yùn)用系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)的理論和技術(shù)方法，整合由基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝物組研究獲得的“組學(xué)”生物信息數(shù)據(jù)以及其他生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床研究數(shù)據(jù)，闡明疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的規(guī)律和調(diào)控機(jī)制，建立基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論的疾病數(shù)學(xué)模型；基于該理論闡明白血病有效治療藥物的藥理機(jī)制，篩選和鑒定新型藥靶，研究和開發(fā)新型藥物及 新型治療方案， 發(fā)展靶向治療的理論 ，力爭(zhēng)在白血病靶向治療方面取得新突破；同時(shí)完善和開發(fā)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相關(guān)新技術(shù)、新模型和新理論研究，促進(jìn)多學(xué)科交叉研究，為提高我國(guó)生物醫(yī)學(xué)研究整體水平和國(guó)際影響力作出貢獻(xiàn)。 9. 阻斷自身免疫反應(yīng)的激活治療 RA 的實(shí)驗(yàn)研究 10. 鑒定獲得的治療效果較好的變構(gòu)肽對(duì) RA 病人的自 身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活性的影響。 10. 系統(tǒng)性發(fā)現(xiàn) RA 的差異性表達(dá)基因及其特征 ， 發(fā)現(xiàn) RA 特征 miRNA。 15. 對(duì)變構(gòu)肽經(jīng)不同免疫方式治療小鼠 CIA 的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。 17． 獲得較大量純化的人源化抗 Cyr61 抗體用于研究其藥效、藥代和毒理等體外實(shí)驗(yàn) 。 20． 制備足量抗 Cyr61 人源化單克隆抗體，并用于小鼠 CIA 模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體系的治療實(shí)驗(yàn) （二）預(yù)期目標(biāo) 1． 闡明獲得的修飾抗原是否具有特異的修飾以及相應(yīng)的修飾特點(diǎn)。 6． 分離純化 Vγ1 和 Vγ4 γδT 細(xì)胞，在體外擴(kuò)增培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至關(guān)節(jié)炎小鼠，觀察不同亞群 γδ T 細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。 6． 評(píng)價(jià) MSCs 對(duì)關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的抑制作用。 9． 分析 Cyr61 和 Wnt/DKK 對(duì)于滑膜細(xì)胞 MMPs 表達(dá)格局及影響。 6． 了解 RA 相關(guān)小分子在 RA 患者外周血各免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況。 11． 析不同 Treg 對(duì) T 細(xì)胞活化的抑制作用，從而評(píng)價(jià)不同 Treg 亞群對(duì) CIA 免疫應(yīng)答的調(diào)控作用。 2）組蛋白乙?；敢种苿┟庖哒{(diào)節(jié)機(jī)制及治療作用研究。 RA 免疫調(diào)控機(jī)制中的作用研究 17 1） RA 相關(guān)小分子在 RA 患者外周血各免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)及功能研究。 2) γδT 細(xì)胞二個(gè)主要亞群在 CIA 的作用：應(yīng)用抗 Vγ1 或 Vγ4 特異性抗體對(duì)相應(yīng)的 Vγ1 和 Vγ4 T 細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)清除，觀察 Vγ1 或 Vγ4 γδT 細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)炎的影響。 3）抗原肽在 HLADRB1 特異性 T 細(xì)胞激活中的作用。 （五）課題相互關(guān)系及設(shè)置： 各課題間相互關(guān) 系 本項(xiàng)目擬從 RA 發(fā)病機(jī)制各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵問題 出發(fā)，以本研究團(tuán)隊(duì)的大量前期工作為基礎(chǔ)，結(jié)合國(guó)外最新研究進(jìn)展設(shè)置課題。而炎癥和骨破壞作為上游免疫反應(yīng)導(dǎo)致的直接致病效應(yīng)，在 RA 發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，是發(fā)病機(jī)制上游環(huán)節(jié)致病作用的驗(yàn)證，也為新 的免疫干預(yù)策略提供最直接的證據(jù)，因此，對(duì) 炎癥和骨破壞啟動(dòng)及進(jìn)展過程的分子機(jī)制 研究十分重要。 4. 系統(tǒng)分析新發(fā)現(xiàn)的自身抗原特異性 T 細(xì)胞表型和功能特征。 2. RA的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究 ：本 項(xiàng)目組長(zhǎng)期從事 RA自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究，在成熟的免疫學(xué)研究平臺(tái)基礎(chǔ)上，對(duì)抗原特異性 T細(xì)胞的自身免疫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行深入研究，以項(xiàng)目組前期工作發(fā)現(xiàn)的新抗原為模型，系統(tǒng)探討抗原特異性 T細(xì)胞抗原表位誘導(dǎo)的 T細(xì)胞活化、新發(fā)現(xiàn)的 T細(xì)胞表面分子免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制等原創(chuàng)性研究，為 RA自身免疫應(yīng)答新機(jī)制研究提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 6. RA 干預(yù)新策略的研究 ： 本項(xiàng)目組成員既往圍繞上述 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進(jìn)行了大量的原創(chuàng)性研究。 13. 對(duì)有臨床應(yīng)用前景的研究結(jié)果申請(qǐng) 相關(guān) 專利。 4. 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)： 1）所在實(shí)驗(yàn)室既有教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)、教育部臨床免疫重點(diǎn)學(xué)科，又有衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、 211 重點(diǎn)學(xué)科，實(shí)驗(yàn)室裝備先進(jìn)，技術(shù)力量雄厚，保證了實(shí)驗(yàn)需要的所有技術(shù)平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)技術(shù)在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先水平。課題一至五，共同為課題六提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而課題六是在其他課題研究的基礎(chǔ)上，研究成果服務(wù)于 RA 治療的必要途徑，為課題一至五提供臨床落腳點(diǎn)。 經(jīng)費(fèi)比例： 15% 承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所、中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 課題負(fù)責(zé)人： 陳唯軍 學(xué)術(shù)骨干： 楊光、牟峰、張明誠(chéng)、董潔、孫宏賀、 趙永岐 課題 RA 的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究 預(yù)期目標(biāo)： 通過系統(tǒng)研究 RA 患者自身抗原特異性 T 細(xì)胞表位和 T 細(xì)胞表面分子調(diào)控自身免疫應(yīng)答的方式，以及不同 T 細(xì) 胞亞群的調(diào)控機(jī)制，深入認(rèn)識(shí) RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活化的致病機(jī)制，最終形成擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的免疫相關(guān)疾病診斷和治療的新產(chǎn)品，提供治療或者控制嚴(yán)重影響我國(guó)人民身體健康的自身免疫病的新策略。 2） Wnt/DKK1 通路在 RA 滑膜細(xì)胞活化中的作用研究。 2） RA 特征性 SNP 的分布研究。 4． 分析早期 RA 患者滑膜組織與外周血中自身反應(yīng)性 TCRV 亞家族的表達(dá)。 19． 構(gòu)建原核表達(dá) RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽。 3． 研究早期 RA 患者的主要 T 淋巴細(xì)胞。 18． 在細(xì)胞水平上，研究 IL17RC 可溶性多肽抑制 RANKL 及炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的生物學(xué)功能。 15． 闡明 IL17RC 可溶性多肽抑制骨破壞和炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的生物學(xué)功能。 15． 檢測(cè)小分子化合物對(duì) CII 免疫后不同階段 CIA 小鼠中 Treg 亞群數(shù)量，格局和功能的改變。 11． 力爭(zhēng)篩選出多個(gè) RA 關(guān)聯(lián)基因和 CNP，闡明其致病機(jī)制。 9. 研究 IL17 與 Cyr61 表達(dá)對(duì)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成與功能的作用。 3. 明確 T 細(xì)胞表位特異性應(yīng)答與疾病相關(guān)性。其免疫原性與靶蛋白比較。 6. 了解 RA 相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)在 RA 自身免疫發(fā)生中的調(diào)控作用。 AMLM2b 型白血病是更為常見的疾病，盡管基礎(chǔ)研究已經(jīng)獲得很大進(jìn)展，但臨床上 還停留在聯(lián)合化療階段，近年來雖然治療緩解率較高，但復(fù)發(fā)、死亡率仍然居高不下，預(yù)后較差。 關(guān)鍵標(biāo)志物的篩選炎性改變癌前病變?cè)缙谖赴┻M(jìn)展轉(zhuǎn)移致病因素宿主因素異常分子表觀修飾惡性轉(zhuǎn)化惡性表型正常細(xì)胞 圖 2 胃癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)示意圖 本項(xiàng)目圍繞以上六個(gè)與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行胃癌標(biāo)志物的篩選 （見圖 2），具體科學(xué)問題是： 1．幽門螺桿菌致癌過程中的關(guān)鍵因子 41 幽門螺桿菌可導(dǎo)致胃癌風(fēng)險(xiǎn)增高已得到公認(rèn)，但不同幽門螺桿菌菌株感染，給予宿主的刺激信號(hào)不同，導(dǎo)致其致病作用不同，但對(duì)何種菌株、那些基因在胃粘膜癌變過程中可引起惡性表型及其具體機(jī)制卻有待于明確，同時(shí)在此過程密切相關(guān)的幽門螺桿菌特異毒素蛋白的功能及相關(guān)機(jī)制也有待闡明，這對(duì)闡明幽門螺桿菌相關(guān)性胃癌遺傳標(biāo)志，對(duì)于胃癌高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體預(yù)警以及幽門螺桿菌有效干預(yù)具有重要意義。根除幽門螺桿菌感染能明顯降低重度癌前病變及胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。另外 CML 治療雖然有一定進(jìn)展，如針對(duì) BCRAbl 融合蛋白的 伊馬替尼 (imatinib)有一定效果，但逐漸發(fā)現(xiàn)有耐藥發(fā)生，因此必須發(fā)展其他治療方案，前期研究 基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論設(shè)計(jì)新型治療方案， 顯示伊馬替尼 (imatinib)和硫化砷（ arsenic sulfide）合用具有協(xié)同作用。 8. 力爭(zhēng)獲得低免疫原性、高親和力的 Cyr61 人源化抗體，為 RA 的免疫干預(yù)提供新干預(yù)靶點(diǎn)和手段，并為進(jìn)入中試生產(chǎn)工藝和臨床研究申報(bào)奠定基礎(chǔ)。 4. 利用 IL6/IL8 基因敲除小鼠，觀察 Th17 及其炎癥因子、 Cyr61 和 Wnt/