【正文】 之間的相互作用及其分子機制。并在前期芯片篩選結果基礎上，對我們發(fā)現(xiàn)的新的 RA 相關小分子進行研究，探討其對各種免疫細胞增殖和分化功能以及膠原性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的影響。在前期工作基礎上，本項目利用我們獨有的轉基因動物平臺和充足的臨床樣本來源，對不同亞型調節(jié)性 T 細胞在 CIA 及 RA 患者發(fā)病過程數(shù)量和功能的異常以及免疫 負調控機制、間充質干細胞對 CIA 及 RA 患者 T細胞活化的抑制作用進行了深入探討。 8. 探討一系列小分子參與 RA 自身免疫反應負調控的分子機制。 2）團隊內長期的廣泛合作為項目順利進行奠定堅實的基礎，可使各課題間的密切聯(lián)系得以實現(xiàn)。為此，本項目擬設置六個課題： 課題一、 RA 相關新型自身抗原鑒定及修飾特點研究；課題二、 RA 的自身 免疫應答機制研究；課題三、 RA 相關炎癥及免疫損傷機制；課題四、 RA 細胞免疫負調控機理研究；課題五、 RA 易感基因及早期診斷靶標研究；課題六、 RA 干預新策略的研究。 3）修飾抗原在 HLADR4 遺傳背景下誘 發(fā)關節(jié)炎的實驗研究。 研究內容： 在 RA 的炎癥啟動、進展及骨破壞過程中， Th17 等免疫細胞與滑膜細胞間的相互作用及分子調控機制是目前研究的熱點。 研究內容： 遺傳是 RA 發(fā)病的重要因素之一，本團隊已經(jīng)建立了先進的 RA 遺傳易感性研究平臺，對 RA 免疫遺傳學機制的深入研究是發(fā)現(xiàn)新的基因靶標用于臨床診斷和治療的重要途徑。 2） RANKL TNF 樣區(qū)疫苗對 RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。同時進行高通量 RA 易感 SNP 的篩選，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 RA 關聯(lián)基因。 10． 力爭篩選出 針對 RA 相關炎癥新靶點的特異性 siRNA。 13． 篩選 RA 易感 CNP。 10． 優(yōu)化或完善小分子化合物，獲得可選擇性調控 Treg 亞群分化的系列最佳娃兒藤堿類小分子化合物。 10． 分析 RA 患者外周血 Treg、 Th Th17 分布，探討 Treg 分布變化與 Th24 Th17 分布的相關性。 5． 了解不同亞群 T 細胞對關節(jié)炎的調節(jié)作用。 4. 完成糖表位特抗體和抗 T 細胞抗體調節(jié) RAT 細胞功能的體外實驗。 19. OPGHSP 重組蛋白的安全性和藥代動力學等的研究。 15. 評價 OPGHSP 重組蛋 白的安全性、抗原性等指標。 14. 人源化抗 Cyr61 抗體的毒理、藥代、藥動力學及相關申報臨床研究所需制備測試與準備。 4. 通過本項目的實施，培養(yǎng)一批能夠進行系統(tǒng)生物醫(yī)學研究和攻關的優(yōu)秀中青年學術帶頭人和科技骨干，形成一支精干的隊伍。表觀遺傳組等 技術體系用于腫瘤或白血病研究； 基于單細胞的納米分析技術方法研究 和新型蛋白質組相關技術并應用于白血病研究，獲得更多結果并評價新型技術質量和實用性； 2．在分析 10 個樣本全外顯子測序 結果基礎上，在較大量的樣本（ 50100 例）中進一步評估 突變基因 頻率 ， 進行臨床關聯(lián)分析， 為作為診斷靶標奠定基礎； 3．整合各種 “組 學” 分析包括有效 藥物作用 “組學”數(shù)據(jù)分析，并進行生物信息學分析，獲得 生物分子相互作用網(wǎng)絡和調控網(wǎng)絡 ；尋找和鑒定一批（ 2030）關鍵網(wǎng)絡節(jié)點分子；有選擇對一些重要功能基因、節(jié)點分子進行深入研究，探討其作為藥物靶標的可能性； 4．設計新型治療方案進行動物實驗，獲得相關數(shù)據(jù)；完善新型藥物或治療方案臨床前資料，爭取申報新藥證書或者相關管理部門批準用于臨床研究； 5．總結在 APL、 AMLM2b 和 CML 獲得各種“組學”數(shù)據(jù)，利用新理論和新技術分析和整合數(shù)據(jù)，建立初步數(shù)學模型； 38 6． 在國內外一流學術刊物上發(fā)表論文 610 篇，申請專利 35 項。 4． 胃癌前病變中表觀修飾調控的關鍵靶點 胃癌在發(fā)生過程中不僅有基因水平的變化，表觀遺傳變異是癌癥發(fā)展過程中的另一個重要事件，本課題組以往證明，癌癥相關基因的啟動子甲基化在胃癌變過程中是一個普遍現(xiàn)象，在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中有十分重要的作用，發(fā)現(xiàn)并利用這些甲基化基因有望找到更多具有潛在臨床應用價值的關鍵靶點。 36 四、年度計劃 第一年 1．建立和完善系統(tǒng)生物醫(yī)學研究技術平臺體系：尤其完善基因組、轉錄組、蛋白組、表觀遺傳組等系統(tǒng)生物醫(yī)學平臺技術，啟動基于單細胞的納米分析技術方法研究 和新型蛋白質組相關技術開發(fā) ； 2． APL、 AMLM2b 和 CML 患者樣本收集、完善白血病細胞模型、動物模型以及初步建立藥物篩選技術體系和臨床評價體系； ，完成 23 個 樣本全外顯子測序，完善基因組突變分析策略和方法，力爭鑒定一批突變基因； 啟動 對 APL、 AMLM2b 和 CML 相應的細胞模型和動物模型以及患者樣本進行“組學” 分析，初步獲得一批“組學”數(shù)據(jù)，建立并完善“組學”相關生物信息分析策略和技術，評價分析策略的合理性； 4． 有效藥物作用 “組學”數(shù)據(jù) 分析： 以 AML－ M2b 細胞模型、動物模型和患者樣本為對象，分析天然產(chǎn)物冬凌草甲素和毛萼乙素以及其衍生物對 AMLM2b 細胞 作用后“組學”數(shù)據(jù)變化，獲得一批“組學”數(shù)據(jù)，并進行初步分析； 以 CML（包括急性變）細胞模型、動物模型和患 者樣本為對象，分析 有效藥物對“組學”數(shù)據(jù)的影響，初步獲得一批“組學”數(shù)據(jù)； 5．探討新理論和新技術分析和整合數(shù)據(jù)的可行性； 6． 在國內外一流學術刊物上發(fā)表論文 35 篇，申請專利 35 項。 31 32 二、預期目標 （一）總體目標： 以我國有深厚研究積累和特色的白血病 APL和 AMLM2b亞型以及 CML為研究對象，運用系統(tǒng)生物醫(yī)學的理論和技術方法，整合由基因組、表觀基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝物組研究獲得的“組學”生物信息數(shù)據(jù)以及其他生物學實驗和臨床研究數(shù)據(jù)，闡明疾病發(fā)生、發(fā)展和轉歸的規(guī)律和調控機制，建立基于系統(tǒng)生物醫(yī)學理論的疾病數(shù)學模型；基于該理論闡明白血病有效治療藥物的藥理機制，篩選和鑒定新型藥靶，研究和開發(fā)新型藥物及 新型治療方案， 發(fā)展靶向治療的理論 ，力爭在白血病靶向治療方面取得新突破；同時完善和開發(fā)系統(tǒng)生物醫(yī)學和轉化醫(yī)學相關新技術、新模型和新理論研究，促進多學科交叉研究，為提高我國生物醫(yī)學研究整體水平和國際影響力作出貢獻。 9. 阻斷自身免疫反應的激活治療 RA 的實驗研究 10. 鑒定獲得的治療效果較好的變構肽對 RA 病人的自 身反應性 T 細胞活性的影響。 10. 系統(tǒng)性發(fā)現(xiàn) RA 的差異性表達基因及其特征 ， 發(fā)現(xiàn) RA 特征 miRNA。 15. 對變構肽經(jīng)不同免疫方式治療小鼠 CIA 的效果進行評價。 17． 獲得較大量純化的人源化抗 Cyr61 抗體用于研究其藥效、藥代和毒理等體外實驗 。 20． 制備足量抗 Cyr61 人源化單克隆抗體，并用于小鼠 CIA 模型和體外細胞實驗體系的治療實驗 （二）預期目標 1． 闡明獲得的修飾抗原是否具有特異的修飾以及相應的修飾特點。 6． 分離純化 Vγ1 和 Vγ4 γδT 細胞，在體外擴增培養(yǎng)，轉移至關節(jié)炎小鼠，觀察不同亞群 γδ T 細胞對關節(jié)炎的調節(jié)作用。 6． 評價 MSCs 對關節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的抑制作用。 9． 分析 Cyr61 和 Wnt/DKK 對于滑膜細胞 MMPs 表達格局及影響。 6． 了解 RA 相關小分子在 RA 患者外周血各免疫細胞亞群中的表達情況。 11． 析不同 Treg 對 T 細胞活化的抑制作用，從而評價不同 Treg 亞群對 CIA 免疫應答的調控作用。 2）組蛋白乙?；敢种苿┟庖哒{節(jié)機制及治療作用研究。 RA 免疫調控機制中的作用研究 17 1） RA 相關小分子在 RA 患者外周血各免疫細胞亞群中的表達及功能研究。 2) γδT 細胞二個主要亞群在 CIA 的作用：應用抗 Vγ1 或 Vγ4 特異性抗體對相應的 Vγ1 和 Vγ4 T 細胞進行體內清除，觀察 Vγ1 或 Vγ4 γδT 細胞對關節(jié)炎的影響。 3）抗原肽在 HLADRB1 特異性 T 細胞激活中的作用。 （五）課題相互關系及設置： 各課題間相互關 系 本項目擬從 RA 發(fā)病機制各環(huán)節(jié)的關鍵問題 出發(fā)，以本研究團隊的大量前期工作為基礎，結合國外最新研究進展設置課題。而炎癥和骨破壞作為上游免疫反應導致的直接致病效應，在 RA 發(fā)病機制中具有重要作用，是發(fā)病機制上游環(huán)節(jié)致病作用的驗證，也為新 的免疫干預策略提供最直接的證據(jù)，因此，對 炎癥和骨破壞啟動及進展過程的分子機制 研究十分重要。 4. 系統(tǒng)分析新發(fā)現(xiàn)的自身抗原特異性 T 細胞表型和功能特征。 2. RA的自身免疫應答機制研究 ：本 項目組長期從事 RA自身免疫應答機制研究，在成熟的免疫學研究平臺基礎上，對抗原特異性 T細胞的自身免疫應答機制進行深入研究，以項目組前期工作發(fā)現(xiàn)的新抗原為模型，系統(tǒng)探討抗原特異性 T細胞抗原表位誘導的 T細胞活化、新發(fā)現(xiàn)的 T細胞表面分子免疫應答調控機制等原創(chuàng)性研究，為 RA自身免疫應答新機制研究提供重要實驗依據(jù)。 6. RA 干預新策略的研究 ： 本項目組成員既往圍繞上述 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進行了大量的原創(chuàng)性研究。 13. 對有臨床應用前景的研究結果申請 相關 專利。 4. 實驗平臺： 1）所在實驗室既有教育部創(chuàng)新團隊、教育部臨床免疫重點學科，又有衛(wèi)生部重點實驗室、 211 重點學科，實驗室裝備先進，技術力量雄厚，保證了實驗需要的所有技術平臺，實驗技術在國內處于領先水平。課題一至五，共同為課題六提供理論基礎和實驗依據(jù)，而課題六是在其他課題研究的基礎上，研究成果服務于 RA 治療的必要途徑，為課題一至五提供臨床落腳點。 經(jīng)費比例： 15% 承擔單位： 中國科學院北京基因組研究所、中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 課題負責人： 陳唯軍 學術骨干： 楊光、牟峰、張明誠、董潔、孫宏賀、 趙永岐 課題 RA 的自身免疫應答機制研究 預期目標： 通過系統(tǒng)研究 RA 患者自身抗原特異性 T 細胞表位和 T 細胞表面分子調控自身免疫應答的方式，以及不同 T 細 胞亞群的調控機制，深入認識 RA 自身反應性 T 細胞活化的致病機制，最終形成擁有自主知識產(chǎn)權的免疫相關疾病診斷和治療的新產(chǎn)品，提供治療或者控制嚴重影響我國人民身體健康的自身免疫病的新策略。 2） Wnt/DKK1 通路在 RA 滑膜細胞活化中的作用研究。 2） RA 特征性 SNP 的分布研究。 4． 分析早期 RA 患者滑膜組織與外周血中自身反應性 TCRV 亞家族的表達。 19． 構建原核表達 RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽。 3． 研究早期 RA 患者的主要 T 淋巴細胞。 18． 在細胞水平上，研究 IL17RC 可溶性多肽抑制 RANKL 及炎性細胞因子產(chǎn)生的生物學功能。 15． 闡明 IL17RC 可溶性多肽抑制骨破壞和炎癥反應相關因子的生物學功能。 15． 檢測小分子化合物對 CII 免疫后不同階段 CIA 小鼠中 Treg 亞群數(shù)量，格局和功能的改變。 11． 力爭篩選出多個 RA 關聯(lián)基因和 CNP，闡明其致病機制。 9. 研究 IL17 與 Cyr61 表達對于成骨細胞和破骨細胞的形成與功能的作用。 3. 明確 T 細胞表位特異性應答與疾病相關性。其免疫原性與靶蛋白比較。 6. 了解 RA 相關炎癥新靶點在 RA 自身免疫發(fā)生中的調控作用。 AMLM2b 型白血病是更為常見的疾病，盡管基礎研究已經(jīng)獲得很大進展，但臨床上 還停留在聯(lián)合化療階段，近年來雖然治療緩解率較高，但復發(fā)、死亡率仍然居高不下，預后較差。 關鍵標志物的篩選炎性改變癌前病變早期胃癌進展轉移致病因素宿主因素異常分子表觀修飾惡性轉化惡性表型正常細胞 圖 2 胃癌發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)示意圖 本項目圍繞以上六個與胃癌發(fā)生密切相關的關鍵環(huán)節(jié)進行胃癌標志物的篩選 （見圖 2），具體科學問題是： 1．幽門螺桿菌致癌過程中的關鍵因子 41 幽門螺桿菌可導致胃癌風險增高已得到公認，但不同幽門螺桿菌菌株感染，給予宿主的刺激信號不同，導致其致病作用不同，但對何種菌株、那些基因在胃粘膜癌變過程中可引起惡性表型及其具體機制卻有待于明確，同時在此過程密切相關的幽門螺桿菌特異毒素蛋白的功能及相關機制也有待闡明，這對闡明幽門螺桿菌相關性胃癌遺傳標志，對于胃癌高風險個體預警以及幽門螺桿菌有效干預具有重要意義。根除幽門螺桿菌感染能明顯降低重度癌前病變及胃癌的發(fā)病風險。另外 CML 治療雖然有一定進展，如針對 BCRAbl 融合蛋白的 伊馬替尼 (imatinib)有一定效果，但逐漸發(fā)現(xiàn)有耐藥發(fā)生，因此必須發(fā)展其他治療方案，前期研究 基于系統(tǒng)生物醫(yī)學理論設計新型治療方案， 顯示伊馬替尼 (imatinib)和硫化砷（ arsenic sulfide）合用具有協(xié)同作用。 8. 力爭獲得低免疫原性、高親和力的 Cyr61 人源化抗體，為 RA 的免疫干預提供新干預靶點和手段，并為進入中試生產(chǎn)工藝和臨床研究申報奠定基礎。 4. 利用 IL6/IL8 基因敲除小鼠，觀察 Th17 及其炎癥因子、 Cyr61 和 Wnt/