【正文】 闡明細胞外信號分子對關(guān)鍵功能基因基因表達調(diào)控及其機制； 完成 36 個 骨骼肌和脂肪生長發(fā)育關(guān)鍵基因的表觀遺傳學分析 。 23 研究內(nèi)容 預(yù)期目標 第 四 年 繼續(xù)上年度關(guān)鍵基因的功能和信號通路研究，同時分析關(guān)鍵功能基因在品種（系）的表達、啟動子區(qū)序列多態(tài)性以及 DNA甲基化及組蛋白修飾等差異。 發(fā)表 SCI 論文 10 篇以上，其中影響因子 5 的 4－ 6 篇。 利用基因組改 造技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物。 進行雞基因組提取及超聲波破碎及甲基化 DNA 免疫共沉淀富集，為表觀測序積累樣本。 發(fā)表 SCI 文章 10 篇，其中 IF5 的文章 5 篇；申請相關(guān)專利 12 項；培養(yǎng)博士研究生 57 人，碩士研究生 1012 人，博士后研究人員 13 人。研 究肌肉和脂肪前體干細胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子參與細胞分化和成熟的調(diào)控機制，從而解析骨骼肌和脂肪發(fā)育關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 主要研究目標 13 建立豬、雞肌肉與脂肪胚胎干細胞和成體干細胞庫。本項目選擇豬和雞作為實驗動物模型，不僅可以彌補其它模式動物研究的許多不足，而且可以從比較生物學的角度深入探討肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控分子機制與進化。 同時，闡明了脂肪細胞內(nèi)脂滴包被蛋白 Perilipin 和 ADRP 的泛素化修飾調(diào)節(jié)機制，研究了Perilipin 下調(diào)及其磷酸化調(diào)節(jié)脂肪分解的分子機制，對 PPARγ 激動劑及甾體類激素調(diào)節(jié)脂肪生成和脂肪分解的分子機制的研究也在進行。 本項目針對上述問題展開研究，結(jié)合我們前期的工作基礎(chǔ)，運用現(xiàn)代生物技術(shù)的先進方法，從胚胎期組織發(fā)生、細胞分化、出生后生長和發(fā)育等多階段，在DNA、 RNA、蛋白質(zhì)等多層次上展開研究，期望在豬、雞骨骼肌和脂肪發(fā)育調(diào)控的遺傳學、表觀遺傳學與外周信號調(diào)控機制多方面取得重大突破，為推進我國發(fā)育生物學、比較醫(yī)學和畜禽的遺傳育種研究與實踐奠定堅實理論與技術(shù) 基礎(chǔ)。這一目標的實現(xiàn)，將取得在豬、雞 肌肉和脂肪干細胞分化機制認識方面的突破，提升我國在豬、雞肌肉和脂肪干細胞方面的研究水平。 研究 豬、雞肌肉和脂肪干細胞分化與組織發(fā)育的表觀遺傳學機制。（ 4）近年來，通過干細胞技術(shù)和基因敲除等手段，在大小鼠等經(jīng)典模式動物的骨骼肌和脂肪發(fā)育研究方面取得了 一系列的進展，揭示了控制干細胞分化及骨骼肌和脂肪發(fā)育的多種重要基因和調(diào)控通路。 探索 miRNA 雞培育的新技術(shù)手段。利用 miRNA 對特定基因沉默效率控制的理論和技術(shù)，建立起可用于生產(chǎn)實踐的 miRNA 雞的培育技術(shù)方法。 發(fā)表研究論文 SCI 論文 40 篇以上，其中在影響因子 以上國際主流雜志發(fā)表論文 20 篇左右。國內(nèi)外研究和本項目團隊前期對豬、雞肌 肉和脂肪發(fā)育的調(diào)控研究也取得了一定進展， 發(fā)現(xiàn)了大量與豬、雞肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控相關(guān)的功能基因 。本項目具有豐富的前期工作積累 10 與相關(guān)研究成果及多學科背景的研究隊伍，已經(jīng)建立起成熟的研究手段和方法，有能力完成所計劃的研究任務(wù)。其中，課題 1 所建立的細胞誘導(dǎo)分化模型以及確定的細胞分化階段的分子標志為課題 4 研究的重要基礎(chǔ)；課題 2 有關(guān)非編碼 RNA 的研究和課題 3 中對功能基因與細胞代謝網(wǎng)絡(luò)的解析，直接解釋細胞各分化階段標志蛋白啟動表達的分子機制，為課題 1的研究深入提供參考；課題 2 揭示的非編碼 RNA 的調(diào)控作用還是對課題 3 調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)認識的補充；課題 4 主要闡明中不同 DNA 遺傳背景動物課題 3 過程發(fā)展和機制發(fā)生的差異，進一步深 化對其研究結(jié)果的認識，同時課題 4 的研究又需要以課題 3 研究對細胞分化分子調(diào)控通路的認識為基礎(chǔ)。 miRNA 在脂肪和肌肉胚胎發(fā)育中的生物學功能研究 14 分析特定 miRNA 在豬和雞胚胎發(fā)育中表達的時間和部位；研究該 miRNA對體節(jié)發(fā)生和肌肉祖細胞、間充質(zhì)細胞進一步分化的影響，從而確定一些 miRNA與骨骼肌和脂肪發(fā)育之間的關(guān)系。從而闡明脂肪、蛋白質(zhì)代謝途徑的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶類對肌細胞、脂肪細胞生長發(fā)育以及對肉品質(zhì)的影響，同時，研究各發(fā)育時期關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 主要研究目標 了解不同豬種、雞種或品系肌肉或脂肪組織的生長發(fā)育規(guī)律。 揭示豬、雞骨骼肌和脂肪在胚胎期和出生后的生長發(fā)育的規(guī)律。 建立 豬骨骼肌和雞前脂肪細胞的小 RNA 文庫，確定 28 個 miRNA的靶基因，闡明 12 個特定 miRNA在肌肉、脂肪發(fā)育中的功能和對其信號通路的調(diào)節(jié)方式。 繼續(xù)完善高低脂系相關(guān)基因表達水平與關(guān)鍵基因的相關(guān)性分析。 獲得 第 二代 miRNA 雞。申報國家專利 48 項。 闡明 miRNA 靶基因 35 個， 闡明 24 個特定 miRNA 在肌肉、脂肪發(fā)育中的功能和對其信號通路的調(diào)節(jié)方式。 揭示 10 個以上功能基因與標志性分子在不同品種（品系）豬、雞骨骼肌和脂肪干細胞分化過程中的表達差異；闡明它們在骨骼肌和脂肪干細胞分化過程中的功能及作用機制。 揭示骨骼肌和脂肪干細胞分化過程中的基因表達 譜和蛋白質(zhì)組的變化；確定骨骼肌和脂肪干細胞分化過程中的候選功能基因與分子標志 15個以上。 完成 LATS2 基因的克隆及相關(guān)分析； 初步揭示 PPARγ 和糖皮質(zhì)激素及其代謝性核受體調(diào)節(jié)脂肪代謝的分子機制。 重要基因的功能研究及其在醫(yī)學以及動物育種中的意義 利用 反向遺傳學技術(shù)，結(jié)合構(gòu)建的各種細胞系，研究骨骼肌和脂肪發(fā)育相關(guān)關(guān)鍵基因的生物學功能，通過構(gòu)建小型豬醫(yī)學模型，研究這些因子的生理學作用，初步確定在人類醫(yī)學應(yīng)用的價值。研究腎上腺素、胰島素、糖皮質(zhì)激素等、脂肪細胞因子、以及 PPAR 代謝性核受體配體藥物等對脂肪分解的調(diào)控作用和機制，并由此揭示脂肪生成、分化、以及分解代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機制。 發(fā)表 SCI 論文 10 篇以上， IF5 論文 5 篇以上；申請發(fā)明專利 12 項；培養(yǎng)博士研究生 57 人，碩士研究生 1215 人，博士后研究人員 13 人。本項目根據(jù) 骨骼肌和脂肪的發(fā)育的基本過程和基因表達的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)層次 擬設(shè)置 4 個課題：（ 1）骨骼肌和脂肪干細胞的自我更新和分化的分子機制；（ 2）非編碼 RNA 在骨骼肌和脂肪組織分化過程中的分子調(diào)控機制；（ 3）骨骼肌和脂肪發(fā)育過程中功能基因與細胞代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；（ 4）品系間骨骼肌和脂肪發(fā)育差異的分子遺傳學機制。本項目課題負責人和主要學術(shù)骨干都由具有多年研究經(jīng)驗和高度組織能力的學術(shù)帶頭人擔任，在發(fā)育生物學、細胞生物學、分子生物學等領(lǐng)域具有多年的研究經(jīng)驗。 可行性分析 （ 1） 對肌肉與脂肪發(fā)育及其調(diào)控機理的研究有可靠的 理論基礎(chǔ)。 建立可用于生產(chǎn)實踐的 miRNA 雞的培育的技術(shù)方法。 研究 miRNA 雞培育技術(shù)。 在發(fā)掘控制 豬和雞骨骼肌與脂肪組織生長與分化 重要功能基因和調(diào)控通經(jīng)的基礎(chǔ)上，著重解析這些基因的 代謝與 表觀遺傳學 調(diào)控機制；系統(tǒng)分離鑒定與豬、雞與 骨骼肌和脂肪發(fā)育相關(guān)的非編碼 RNA，揭示其功能機制， 闡明 品系間骨骼肌和脂肪生長發(fā)育差異的分子遺傳與調(diào)節(jié)機制。（ 5）雖然轉(zhuǎn)基因豬和雞都有成功的報道，但技術(shù)方法尚未能達到實際生產(chǎn)應(yīng)用的要求，也未見涉及針對 調(diào)控發(fā)育基因方面的研究。 研究非編碼 RNA 在豬、雞干細胞分化與組織發(fā)育的中的作用。 miRNA 文庫將達到國內(nèi)領(lǐng) 6 先和國際先進水平，同時使我國在 miRNA 對豬、雞骨骼肌和脂肪發(fā)育控制作用及其調(diào)控機制方面的研究進入國際先進行列。同時，進行 miRNA 雞培育新技術(shù)方法研究，力爭培育成功優(yōu)化肌肉和脂肪生長的 miRNA雞。 對 中外豬種肌肉發(fā)育差異的分子機制研究以及豬和雞基因組非編碼 RNA 的研究也取得了進展。因此 ，本研究在研究對象的選擇上具有一定的創(chuàng)新。 建立豬、雞肌肉與脂肪胚胎干細胞和成體干細胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化模型。通過轉(zhuǎn)錄因子 /DNA結(jié)合實驗，結(jié)合報告基因技術(shù)、采用高效毛細管電泳法、甲基化間區(qū)位點擴增（ AIMS）、Gelshift 技術(shù)和染色質(zhì)免疫共沉淀（ ChIP 或 ChIPonchip）等技術(shù)驗證肌肉和脂肪細胞 分化過程中轉(zhuǎn)錄因子及其與轉(zhuǎn)錄輔助因子的相互作用的網(wǎng)絡(luò)。 品種（系）間骨骼肌和脂肪發(fā)育的比較轉(zhuǎn)錄組學分析 利用比較轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分