【正文】 的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù) 外源蛋白質(zhì)檢測(cè) 利用插入 DNA所表達(dá)的蛋白質(zhì)的 功能 或者 結(jié)構(gòu) 性質(zhì)，檢測(cè)外源蛋白質(zhì)的存在。（ 空載體 ） ? 如果在 LacZ基因區(qū)段插入外源性目的基因，就會(huì)造成 LacZ基因的失活，結(jié)果就不生成藍(lán)色菌落。 實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件方面： 實(shí)驗(yàn)操作對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大，特別是電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化電壓，電容，電阻等參數(shù)的設(shè)置非常重要。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；?DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 （三）具體方法： 同種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端連接 同尾酶產(chǎn)生的粘性末端連接 不同限制性內(nèi)切酶粘性末端的連接 人工粘性末端的連接 5’突出末端 人工粘性末端的連接 3’突出末端 粘性末端的添加與更換，利用人工接頭 Linker 幾種主要的連接策略 同種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端連接 同尾酶產(chǎn)生的粘性末端連接 不同限制性內(nèi)切酶粘性末端的連接 人工粘性末端的連接 5’突出末端 人工粘性末端的連接 3’突出末端 粘性末端的添加與更換，利用人工接頭 Linker 二、接（體外重組） （一）重組率 含有外源 DNA的重組分子數(shù) /載體分子總數(shù) （二）重組特性： 粘性末端的重組率 大大高于 平末端。 目前，我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)了 12種基因工程藥物和疫苗上市。 （ 3）激素 胰島素、生長(zhǎng)激素、心鈉素、人腦激素。 表達(dá)載體 (expression vector) 使插入的外源 DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯 ， 表達(dá)出多肽鏈 ， 這樣的載體稱為 表達(dá)載體 。 用途 ⒈ 制備載體 時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子 5’－端磷酸基后，可 防止載體自身環(huán)化 連接，提高重組效率。539。539。 539。 539。 339。 (2) 分類、作用 ?Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ （基因工程技術(shù)中常用 Ⅱ 型） 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名第一個(gè)字母 ， 用大寫 ； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母，用小寫 ； 第四個(gè)字母代表菌株類型 ； 如果菌株有幾種酶，在代表菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。 （一）、基因工程的相關(guān)概念 有時(shí)應(yīng)用重組 DNA技術(shù)的分離、獲得某一感興趣的基因或DNA序列，有時(shí)是為獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物 蛋白質(zhì)。 1973年， 科恩（ Cohen）等人用 EcoR I內(nèi)切酶處理大腸桿菌的抗四環(huán)素和抗青霉素及磺胺的質(zhì)粒，并連接成一個(gè)新的重組質(zhì)粒。 1966年，發(fā)現(xiàn) DNA連接酶。 （二）、技術(shù)上三個(gè)重要成果 1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué) Berg研究小組利用限制性內(nèi)切酶EcoR I 和 T4 DNA連接酶成功地進(jìn)行了首例體外基因重組實(shí)驗(yàn)。 重組子轉(zhuǎn)化的成功標(biāo)志著基因工程的誕生 。其中，為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的克隆載體又稱表達(dá)載體。 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 同尾酶 有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同 ， 但切割 DNA后 ， 產(chǎn)生相同的粘性末端 ，稱為同尾酶 。 339。 339。 逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用： ⑴ 將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，構(gòu)建 cDNA文庫(kù) ； ⑵ 補(bǔ)平和標(biāo)記 5ˊ 末端突出的 DNA片段； ⑶ 代替 Klenow酶用于 DNA序列分析； ⑷ 制備雜交探針等。339。339。 （脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 作用 將標(biāo)記或未標(biāo)記的 dNTP加到 DNA的 3’ OH末端；也可催化載體分子或待克隆的 DNA片段上加上互補(bǔ)的同聚尾 ， 便于進(jìn)一步連接 。 ③必須具有選擇標(biāo)記，承載外源 DNA的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，以便篩選克隆子。 （ 2）可以通過(guò) 大批量 的生產(chǎn)方法獲得足夠數(shù)量的生物活性物質(zhì)。 ? 1982年 第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用。 利用中間載體提供酶切位點(diǎn) ? 例： Taq酶特點(diǎn)，常會(huì)在 3’末端添加一個(gè)脫氧腺苷酸（ A），因此，為克隆 PCR產(chǎn)物，設(shè)計(jì)一個(gè)特殊的載體 T載體 ， ? 其特點(diǎn)是 3’末端含有一個(gè)脫氧胸腺苷酸（ T）。 鈣離子轉(zhuǎn)化法： 106109/ug 超螺旋質(zhì)粒 電轉(zhuǎn)化法： 1081010 /ug 超螺旋質(zhì)粒 例如， pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為 108，即每微克 pUC18中只有 108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。 抗藥性檢測(cè)篩選法 對(duì)于將外源 DNA插入 BamHⅠ 和 SalⅠ 之間位點(diǎn) 2. 顯色檢測(cè) — β半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)： IPTG可誘導(dǎo) LacZ基因片段編碼 β半乳糖苷酶氨基端片段 ,與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型 β半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，又稱 α互補(bǔ) 。 PCR擴(kuò)增檢測(cè) 用 PCR的方法檢測(cè)是否插入外源基因