基因工程制藥-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 也稱克隆載體。 (3)命名 EcoRⅠ 屬 種 株 序 Escherichia coli RY13株 大腸桿菌 RY13株的第一種酶 (4)Ⅱ 類酶識(shí)別序列特點(diǎn) —— 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 特異識(shí)別及切割 4?8個(gè) bp長(zhǎng)度且具有 回文序列 的DNA片斷，主要產(chǎn)生 3種末端結(jié)構(gòu)： 5ˊ －粘性末端 3ˊ －粘性末端 平端或鈍端 回文序列 (palindrome) 是指該部位的核苷酸序列呈 180O反向重復(fù) 。 339。 539。 dATP,dCTP,dGTP [? 32 P] dTTP E. coli DNA POL I (TaqDNA polymerase) 作用特點(diǎn) 1） Taq DNA pol催化 DNA合成的最適溫度范圍 70 ? 75℃ ， 2） 95℃ 以上高溫，半小時(shí)不失活， 3） 最適合用于 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） 。339。539。 ⒉ 用 32P標(biāo)記 5’ 端前，去除 5’ P，再通過(guò)激酶作用把放射性核苷酸加到 539。 這類載體中含有來(lái)源不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，既具備 原核細(xì)胞 復(fù)制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具有能使外源片段在 真核細(xì)胞 表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)元件和相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因 ,故能在兩種受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)，克隆的外源基因在此類載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)． 穿梭載體（ shuttle vector) ①具有能使外源 DNA片段組入的克隆位點(diǎn)。 （ 4）酶類 尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、超氧化物歧化酶、 a淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑。 七、基因工程制藥生產(chǎn)的化學(xué)工藝學(xué)要求 （ 1）工程菌大規(guī)模 發(fā)酵工藝 最佳參數(shù)的確立 （ 2）新型生物反應(yīng)器的研制 （ 3）高效 分離介質(zhì) 和裝置的開(kāi)發(fā) （ 4）分離 純化技術(shù) 的優(yōu)化控制 （ 5）高純度產(chǎn)品的制備技術(shù) （ 6）生物傳感器等儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造 （ 7）電子計(jì)算機(jī)的智能優(yōu)化控制 八、基因工程的發(fā)展 （一）基因工程的歷史 （二）基因工程所生產(chǎn)的產(chǎn)品 （三）基因工程 的發(fā)展方向 （一）基因工程的歷史 ? 1973年 Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)。 雙酶切片段與載體的重組率 高于 單酶切片段與載體。電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且 幾乎對(duì)所有 含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。 四、增（重組基因的擴(kuò)增） 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞 擴(kuò)增與表達(dá)載體上的標(biāo)記基因及目標(biāo)基因 表達(dá)外源基因 五、 檢（檢測(cè)轉(zhuǎn)化子，獲得重組子） 抗藥性檢測(cè)篩選法 顯色檢測(cè) 限制酶切圖譜檢測(cè) PCR擴(kuò)增檢測(cè) 原位雜交檢測(cè) 外源蛋白質(zhì)功能檢測(cè) 外源性 DNA插入到載體 DNA的某一抗藥性基因區(qū)域時(shí)，會(huì)導(dǎo)致抗藥基因的 失活 。 （ 重組子 ） 顯色篩選法實(shí)例 限制酶切圖譜檢測(cè) 限制性酶切圖譜法 就是對(duì)載體上插入的外源 DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比 利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。適用于表達(dá)載體的檢測(cè)。 優(yōu)點(diǎn)：不需要合適的酶切位點(diǎn)。 lacZ β 半乳糖苷酶 分解 半乳糖 i P O 調(diào)控蛋白 P 大腸桿菌的 β半乳糖苷酶基因 lacZ系統(tǒng) a互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選） lacZ β半乳糖苷酶 分解半乳糖 i P O 調(diào)控蛋白 P α肽段 分解 Xgal 產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色 誘導(dǎo)劑 IPTG β半乳糖苷酶基因 lacZ突變體 M15 藍(lán) 白 篩選： 利用藍(lán)色化合物的形成作為 指示劑 ， 篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌 。 （三）轉(zhuǎn)化率的用途 （四） 轉(zhuǎn)化率的影響因素 載體本身的性質(zhì)： 不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同。 三、轉(zhuǎn)（外源基因?qū)爰?xì)胞） （一）轉(zhuǎn)化方法 大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 酵母的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法 （二）轉(zhuǎn)化率 （三）轉(zhuǎn)化率的用途 （四）轉(zhuǎn)化率的影響因素 大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 （ 1）鈣離子轉(zhuǎn)化法 （ 2）電轉(zhuǎn)化法 （ 3）大腸桿菌的 ?噬菌體轉(zhuǎn)染 （ 1）鈣離子轉(zhuǎn)化法 適用于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌），利用鈣離子與細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，這一狀態(tài)下的細(xì)胞稱為 感受態(tài)細(xì)胞 。 ? 1999年 9月 中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的 1% ? 2023年 6月 26日 科學(xué)家公布人類基因組工作草圖。 （ 4）利用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)可以對(duì)藥物蛋白進(jìn)行 修飾和改造 ，來(lái)提高藥效價(jià)值和獲得新型的化合物。 ⑤具有較高的遺傳穩(wěn)定性。 3180。標(biāo)記探針標(biāo)記末端⑶ 用于 cDNA克隆中第二股鏈的合成 ； ⑷ DNA序列分析。339。外切酶Ⅲ變性+539。 539。 539。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GA
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1