【正文】 ntial regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA(~2023 kb)λ phage12bpλ噬菌體載體的主要類(lèi)型 1. 插入式載體 一種只具有一個(gè)可供外源 DNA插入的克隆位點(diǎn)的 派生載體。 噬菌體的生命周期噬菌體的 溶源 生命周期 是指在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的 DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體 DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌 枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌 釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌 牛乳頭瘤病毒迄今還沒(méi)有發(fā)展出適用的大腸桿菌 植物細(xì)胞穿梭載體。 大腸桿菌 β 半乳糖基因（ lacZ）的啟動(dòng)子及編碼 α 肽鏈的 DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱(chēng)之為lacZ’ 基因； 位于 lacZ’ 基因中的靠近 5’ 端的一段多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。3. 允許外源 DNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。載體分類(lèi)（按功能分）克隆載體：用于外源 DNA的克隆和擴(kuò)增。羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使 DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶 I ① 合成雙鏈 cDNA的第二條鍵② 缺口平移制作高比活探針③ DNA序列分析④ 填補(bǔ) 339。V、 C、 J區(qū)在胚胎期細(xì)胞中相距較遠(yuǎn)，細(xì)胞發(fā)育分化時(shí)，免疫球蛋白重鏈基因 DNA重排，大量間隔序列被切除，使位于 JCμ之間的增強(qiáng)子序列得以發(fā)揮作用，增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄。隨后 DNA會(huì)整合到受體 細(xì)胞的基因 組 中。（ 2）含編碼轉(zhuǎn)座酶的基因 。羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾切除末端磷酸基團(tuán)堿性磷酸酶Taq DNA聚合酶 PCR擴(kuò)增第三節(jié) 基因克隆的載體 載體（ vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的ＤＮＡ分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段可使其它ＤＮＡ片段 (外源基因 )連接在它的上面，進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)?！≠|(zhì)粒（ plasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈 DNA 分子?？寺≥d體的分子量大小不要超過(guò) 10kb。其依據(jù)是 Ampr表型的細(xì)胞可以合成 β –內(nèi)酰胺酶，它能使青霉素轉(zhuǎn)變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結(jié)合。 乳糖操縱子結(jié)構(gòu)與調(diào)控模式圖pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù) 。注入 噬菌體 DNA穿過(guò)細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞。λ噬菌體載體λ 噬菌體基因組長(zhǎng) kb?基因組可為線狀和環(huán)狀兩種形式 (cos ends) 溶菌階段 溶源階段5‘CGGGGCGGCGACCTCG3’3’GCCCCGCCGCTGGAGC5’ 剪切 連接 (包裝過(guò)程 ) (侵染細(xì)菌細(xì)胞后 ) GGGCGGGCGACCTCG3’5’CG + GC5’3’GCCCCGCCGCTGGAThe phage ? cos ends環(huán)狀 線狀 A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 頭部基因 尾部基因 功能不明區(qū) 溶源化 重組 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌生長(zhǎng)非必須區(qū)段cI基因：溶源過(guò)程控制基因。外源基因插入后將導(dǎo)致 cI基因的失活。cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及 λ 噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。這類(lèi)載體主要用來(lái)獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學(xué)研究中主要用來(lái)測(cè)定ＤＮＡ序列（ sanger雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈 DNA的分析等。常用的噬菌粒載體 pUC118和 pUC119 1. 具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組 DNA，可克隆 10kb的外源 DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作； 2. 編碼一個(gè) ampr基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶pUC118或 pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇； 3. 拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá) 500個(gè)，所以只要用少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA； 4. 存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此許多種不同類(lèi)型的外源 DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；5. 由于多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌 lacZ基因的5’ 端編碼區(qū)，可按照 IPTG組織化學(xué)顯色反應(yīng)試驗(yàn)，篩選重組子；6. lacZ基因是置于 lac啟動(dòng)子的控制之下，這樣插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；7. 含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在沒(méi)有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈 DNA分子8. 帶有一個(gè) M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單 DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆粒分泌到培養(yǎng)基中；9. 在 pUC118和 pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈 DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈 DNA；10. 可以直接對(duì)克隆的 DNA片斷進(jìn)行核苷酸的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自猴腎病毒 SV40（Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲(chóng)桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。 通過(guò)改變溫度來(lái)控制 PL啟動(dòng)子的開(kāi)閉真核表達(dá)載體 真核表達(dá)載體的構(gòu)建有：u原核生物的序列，來(lái)自質(zhì)粒的復(fù)制起始序列、抗生素抗性標(biāo)記基因。 重組子的篩選和鑒定 對(duì)于克隆擴(kuò)增問(wèn)題不大，因?yàn)榭寺∩先サ幕蛟僦亟M時(shí)又要切下來(lái)；對(duì)于表達(dá)載體目的基因必須按 5‘ － 3’ 方向克隆在啟動(dòng)子下游而不能反之。6. T載體（ A /T克隆法） 在克隆 PCR產(chǎn)物 cDNA時(shí)可采用這一方法。四、重組 DNA（ rDNA）導(dǎo)入受體細(xì)胞2. 受體細(xì)胞的基本條件 (1)易接納 rDNA分子； (2)對(duì)載體復(fù)制擴(kuò)增無(wú)嚴(yán)格限制； (3)不降解，不修飾外源DNA分子。五 重組體的篩選與鑒定（一）遺傳學(xué)方法1. 抗生素抗性篩選（插入失活） 此法適用于帶有抗生素抗性標(biāo)記基因的克隆載體， 將外源 DNA插入到 其一抗生素基因序列內(nèi)，該基因就失活，據(jù)此特性，設(shè)計(jì)一套藥物平板，可篩選出重組子。⒋ 當(dāng) MCS插入外源 gene片斷時(shí)，幾乎無(wú)一例外產(chǎn)生無(wú) α －互補(bǔ)能力的 氨基酸片段（插入酶失落）導(dǎo)致白菌落產(chǎn)生。 使用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌突變體。原核細(xì)胞表達(dá)載體pBV220 、 pET等 , 多種載體有商品化供應(yīng)原核細(xì)胞 RNA聚合酶可以識(shí)別的啟動(dòng)子原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄終止子原核細(xì)胞核糖體結(jié)合位點(diǎn) 其他調(diào)控序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)克隆基因在原核生物中表達(dá)的必要條件是攜帶克隆基因的載體具備原核生物中所需要的以下表達(dá)調(diào)控序列 : 表達(dá)質(zhì)粒 載體 pET的結(jié)構(gòu) 適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子蛋白，尤其那些空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性依賴(lài)于糖基化或磷酸化等修飾的蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)l表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜l成本高l生長(zhǎng)周期長(zhǎng)演講完畢，謝謝觀