【正文】 柱表面傾倒一層滅菌 液體石蠟和固體石蠟的混合物 培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液體培養(yǎng)基分離 ?不能在固體培養(yǎng)基上生長的微生物 仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 三、微生物分離 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 微生物純培養(yǎng)分離技術(shù) ? 純培養(yǎng)物 是指來源于同一單細(xì)胞的細(xì)胞群體。微生物基本操作技術(shù) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 CICC 姚 粟 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 內(nèi) 容 ? 微生物分類 ? 微生物接種和培養(yǎng) ? 微生物的分離 ? 微生物的鑒定 ? 微生物保藏 ? 質(zhì)控微生物 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 微生物的進(jìn)化和多樣性 普遍性系統(tǒng)發(fā)育樹 ,親緣關(guān)系根據(jù) rRNA序列比較來決定。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 平板接種 ? 平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，以及活菌計(jì)數(shù)等； ? 平板接斜面：平板分散的單菌落接于斜面； ? 斜面接平板：點(diǎn)種法、劃線法。 培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而 培養(yǎng)基內(nèi)部 菌落呈 豆?fàn)罨蛲哥R狀 。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 選擇培養(yǎng)基特性 ?促生長能力 ?抑制能力 ?指示（鑒別）能力 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 傳統(tǒng) 選擇性培養(yǎng)基 ? 血平板： 適于各類細(xì)菌的生長，一般細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本的分離，都應(yīng)接種此平板。 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞特征 培養(yǎng)特征 生理生化試驗(yàn) 生長溫度 耐鹽性 碳源利用 發(fā)酵產(chǎn)酸 其他 化學(xué)成分分析 呼吸醌 極性脂 脂肪酸 分枝菌酸 氨基酸和糖 其他 基因型分析 核酸序列 分析 功能基因 分析 DNA雜交 指紋圖譜、 菌株分型 其他 系統(tǒng)發(fā)育分析 16S rDNA ITS區(qū) 26S D1/D2區(qū) 其他 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)菌 酵母 絲狀真菌 宏觀 形態(tài)（培養(yǎng)特征） 將培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布， 30℃ 培養(yǎng) 16~24小時，選取劃線或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質(zhì)地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等 。 ? 六類鑒定試驗(yàn)板，可鑒定 500種細(xì)菌 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 化學(xué)成分分析 ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 呼吸醌 （甲基萘醌和泛醌） ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 極性脂 ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 脂肪酸 除放線菌外的細(xì)菌 ? 外膜： 分枝菌酸 ? 細(xì)胞壁： 肽聚糖 （氨基酸和糖） ? 全細(xì)胞： 糖和蛋白質(zhì) 放線菌 m i n2 . 5 5 7 . 5 10 1 2 . 5 15 1 7 . 5 20pA131415161718 F I D 1 A , ( E 1 2 6 1 9 . 6 0 2 \ A 0 0 4 1 0 8 0 . D ) 1.748 2.032 2.110 3.638 4.066 7.066 8.578 8.720 10.226 10.851 11.529 11.696 11.952 12.116醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 基因型分析 ? G+Cmol% ? 16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, rDNA ITS region, ? βtubulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene, recN gene, rpoB gene and other housekeeping genes. ? DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) ? DNADNA hybridization ? RAPD, RFLP, AFLP, SSCP, EricPCR, BOXPCR, RepPCR , LAMP. 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 基因型分析 DNA 指紋圖譜分析 1 2 3 4 EricPCR BOXPCR RepPCR SSCP ERIC－ PCR 以細(xì)菌 DNA中串聯(lián)重復(fù)序列為引物， 通過擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，在不同種屬個體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)不同，以電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異，應(yīng)用于菌株分型。 ta To180。 C培養(yǎng) 7 d ? Biolog鑒定 ? 生長濁度試驗(yàn) ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 ? ITS4: 5?TCCTCCGCTTATTGATATGC3? ? ITS5: 5?GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3? ? β微管蛋白基因序列 分析 ? Bt2a: 5?GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC3? ? Bt2b: 5?ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC3? 反應(yīng)體系： 100 μL, 10 擴(kuò)增緩沖液 10 μL。 94176。 C培養(yǎng) 7 d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài) Fig Macromorphology and micromorphology on 25176。 +: Strong growth。 CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性 也具有很高的相似性 , 序列同源性均在 %?100%之間 。 五、微生物保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 微生物菌種保藏方法 ?基本原理 是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境，使其長期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性 。 ? 菌種易退化、污染。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空干燥 ? 在開動真空泵后應(yīng)使真空度在 15min內(nèi)達(dá)到 ， 隨后逐漸達(dá)到 ～ ， 在此條件下 ， 樣品將保持凍結(jié)狀態(tài) ， 其中水分則不斷升華 ， 干燥才能順利地進(jìn)行 。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液氮超低溫凍結(jié)法 ? 指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－ 196℃的液氮或－ 150℃ 左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長期菌種保藏方法。s GMP certification is asking, and the Chinese Pharmacopoeia 2022 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages (from the original strain from freezedried powder) should not exceed 5 on behalf of The clearly defined. Enrichment (G1) Separation of singleolony(G2) Working strain (W3) Working strain (W4) Working strain (W5) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 標(biāo)準(zhǔn)菌株提供形式 Accuracy Easy of Use (preparation) High Low Complicated Easy Quanti Cult (REMEL) Standard Strains (ATCC/NBRC etc.) EZCFU one step (MicroBioLogics) KWIKSTIK (MicroBioLogics) Culti Loops (REMEL) BioBall (BTF/bioMerieux) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 質(zhì)控菌株 Primary strain Qualitative strain Quantitative strain 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 視頻材料 ? 質(zhì)控菌株的使用 質(zhì)控菌株