【正文】 處生長(zhǎng)。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他微生物。左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間?！　?shí)驗(yàn)臺(tái)面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。　?。担┩坎冀臃N 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種?！　∮糜嘘P(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24~48小時(shí)，如無(wú)菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不好。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無(wú)菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50176。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時(shí)，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。如過(guò)濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用蛋清澄清法。例如，而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高。４、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化　　培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。根據(jù)培養(yǎng)基用于生產(chǎn)的目的來(lái)區(qū)分，可以分為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基?！　。常╄b別培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助開快速鑒別某種微生物。　?。常┌牍腆w培養(yǎng)基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。根據(jù)對(duì)培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來(lái)區(qū)分，可以將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。用過(guò)的玻璃器皿　　凡確無(wú)病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用后可隨時(shí)沖洗，吸取過(guò)化學(xué)試劑的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定數(shù)量后再集中進(jìn)行清洗。消毒劑在低濃度時(shí)也能殺菌（如1：1000硫柳汞）。通過(guò)過(guò)濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達(dá)到除菌的目的。例如Ca+2與PO43化合，就會(huì)產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。C，10分鐘就會(huì)被殺死；但各種孢子、特別是芽孢最能抗熱，其中抗熱性最強(qiáng)的是嗜熱脂肪芽孢桿菌，要在121176。由于蒸汽壓的上升，水的沸點(diǎn)也隨之提高。C，15~30分鐘，殺死其中的營(yíng)養(yǎng)體。C，30分鐘既可達(dá)到消毒目的。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的尸體等的滅菌?！　。罚┺t梁色液（?。┤?0秒鐘后，自來(lái)水沖洗。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對(duì)結(jié)晶紫—碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽(yáng)性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時(shí)在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過(guò)1—2分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。自然干燥　　涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。酸性染料　　這類染料電離后染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽?！　∮绊懭旧钠渌蛩?，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。化學(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)?！　∫粋€(gè)大方格是16個(gè)中方格時(shí)，應(yīng)當(dāng)數(shù)4角4個(gè)中方格（即100個(gè)小方格）的菌數(shù)，一個(gè)大方格是25個(gè)中方格時(shí)，除取4角4個(gè)中方格外，還要數(shù)中央一個(gè)中方格（即為80個(gè)小方格）的菌數(shù)。四、顯微計(jì)數(shù)　　利用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常見(jiàn)的微生物計(jì)總數(shù)的方法。切勿用手絹或紗布等擦鏡頭。三、普通顯微鏡的保養(yǎng)　　顯微鏡是精密貴重的儀器，必須很好地保養(yǎng)。使用時(shí)，一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。如果視野中出現(xiàn)外界物體的圖像，可以將聚光鏡稍微下降，圖像就可以消失。一般的顯微鏡可用普通的燈光，質(zhì)量高的顯微鏡要用顯微鏡燈，才能充分發(fā)揮其性能。光學(xué)系統(tǒng)一般包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等；機(jī)械系統(tǒng)一般包括鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡臺(tái)、鏡臂和底座等?！　∫弧⑵胀ü鈱W(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和基本原理：：　　光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)放大系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩部分組成。　　顯微鏡用光源，自然光和燈光都可以，以燈光較好，因光色和強(qiáng)度都容易控制。除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點(diǎn)。油浸鏡觀察　　油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。無(wú)論是油浸鏡或高倍鏡觀察，都宜用可調(diào)節(jié)的顯微鏡燈作光源。擦鏡紙要放在紙盒中，以防沾染灰塵。在擦拭目鏡或由于其他原因需要取下目鏡時(shí)，都要用擦鏡紙將鏡筒的口蓋好，以防灰塵進(jìn)入鏡筒內(nèi)，落在鏡筒下面的物鏡上。測(cè)出每個(gè)中方格菌數(shù)，就可以算出一個(gè)大方格的菌數(shù)，由此推算出1毫升菌液內(nèi)所含的菌數(shù)。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色?！　∪玖峡砂雌潆婋x后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿性染料、中性（復(fù)合）染料和單純?nèi)玖纤拇箢?。制片　　在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無(wú)菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過(guò)多聚成集團(tuán)，不利觀察個(gè)體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。餓酸能很快固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu)，故較常用?？蓹z查染料與細(xì)胞結(jié)合的穩(wěn)定程度，鑒別不同種類的細(xì)菌。四、染色方法　　微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。因此，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等?！　〖?xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時(shí)，則可都呈負(fù)反應(yīng)?！　。叮┘?5%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，30秒后水洗，吸去水分。１）干熱滅菌法:　?。豪没鹧嬷苯影盐⑸餆?。該法一般在62176。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100176?！　〖訅赫羝麥缇前汛郎缇奈锲贩旁谝粋€(gè)可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。多數(shù)微生物的營(yíng)養(yǎng)體和病毒在50~65176?！　。@主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。３、過(guò)濾　　采用機(jī)械方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過(guò)濾器。但是一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴(yán)格區(qū)分。對(duì)容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動(dòng)容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸，數(shù)分鐘后傾去鹽酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn)，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型?！　。常┌牒铣膳囵B(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)室中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗(yàn)雜菌、計(jì)數(shù)、保藏、生物測(cè)定等。在某種程度上講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基?！　×硗?，根據(jù)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分是否“完全”，可以分為基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基，這類術(shù)語(yǔ)主要是用在微生物遺傳學(xué)中。完全稱取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。５、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正　　因培養(yǎng)基在加熱消毒過(guò)程中、pH會(huì)有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過(guò)濾。分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。C恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，即棄去。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀察、研究它們的形態(tài)。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。（圖３－４）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過(guò)火焰滅菌，復(fù)原。１、傾注平板法　　首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50176。（圖３－７）４、富集培養(yǎng)法　　富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。接種后，加入無(wú)菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕?！　值是細(xì)菌生長(zhǎng)的很基本的特性常數(shù)。微生物只有處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)速度才最快，代時(shí)最短。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。絕大多數(shù)微生物都屬于這個(gè)類型。２、培養(yǎng)方法1）根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。一般可采用下列幾種方法：　?。撼⑦€原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目的。微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 １、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。（圖３－８）　圖３－８　細(xì)菌的培養(yǎng)特征 　　２）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。　　淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。C或30176。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽(yáng)性，10~20min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。９、氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)　　氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營(yíng)養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36177。1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。　　3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。此法快速、簡(jiǎn)便，但不能進(jìn)行定量測(cè)定。由于載體增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積?！　。玻┬鯛畛恋矸磻?yīng)：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對(duì)應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的絮狀沉淀，此為陽(yáng)性反應(yīng)。由于方法簡(jiǎn)便易行，常用于測(cè)定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。無(wú)菌取樣技術(shù)　　本單元講述了無(wú)菌取樣操作，在討論無(wú)菌取樣的原因和采集方法之前，必須要理解“無(wú)菌的”的這一術(shù)語(yǔ)，“無(wú)菌”一般用于取樣中，意味著取樣過(guò)程中，避免操作引起污染。附加樣品號(hào)碼一般在樣品采集中被正式確定下來(lái)，因此不用預(yù)先標(biāo)明?！　缇萜鳎骸　乃芰洗綔缇募觼銎嵬?，可以用于有銳利邊面的產(chǎn)品如蟹、蝦等?！　‘?dāng)采集無(wú)菌樣品時(shí)，一條最重要的規(guī)則是：千萬(wàn)別污染樣品?！　CMSF推薦的抽樣方案　　ICMSF的采樣設(shè)想及其基本方法　　用于分析所抽樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對(duì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大影響?！　：系指合格菌數(shù)限量，將可接受與不可接受的數(shù)量區(qū)別開。自然界中材料的分布曲線一般是正態(tài)分布，以其一點(diǎn)作為食品微生物的限量值，只設(shè)合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過(guò)m值的，則為不合格品。M值之間，如果有3個(gè)以上檢樣的菌數(shù)是在mamp。表ICMSF按微生物的危害度及食品處理進(jìn)行情況分類級(jí)別危害程度對(duì)象微生物食品經(jīng)不同處理后的危害度減少（加熱）無(wú)變化（冷凍品立刻進(jìn)食）增加危害度（未加熱吃到吃前還有一段時(shí)間）　三級(jí)方案　　細(xì)菌數(shù)大腸菌群大腸桿菌金黃色葡萄球菌（指標(biāo)菌）金黃色葡萄球菌蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌例1n=5 c=3例4n=5 c=3　　例7n=7 c=2例2n=5 c=2例5n=5 c=2　　例8n=5 c=1例3n=5 c=1例6n=5 c=1　　例9n=10 c=1二級(jí)方案沙門氏菌副溶血性弧菌致病性大腸桿菌肉毒梭菌霍亂弧菌傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌例10n=5 c=0例13n=15 c=0例11n=10 c=0例14n=30 c=10例12n=20 c=3例15n=60 c=0注：表中“減少”系指食品經(jīng)加熱殺死污染的細(xì)菌。烹調(diào)加工后的熟肉，對(duì)腐敗菌沒(méi)有抵抗力，則易發(fā)生食物中毒，適用例9。（4）.隨機(jī) 抽樣方案　　在現(xiàn)場(chǎng)抽樣時(shí)，可利用隨機(jī)抽樣表進(jìn)行隨機(jī)抽樣?！　。ㄈ绨碅即第49行的第11和12列的數(shù)字，為608）。確定檢驗(yàn)批，應(yīng)注意產(chǎn)品的均質(zhì)性和來(lái)源，確保檢樣的代表性。5．生產(chǎn)過(guò)程中的抽樣：　　（1）．劃分檢驗(yàn)批次，應(yīng)注意同批產(chǎn)品質(zhì)量的均一性；　?。?）．如用固定在貯液桶或流水作業(yè)線上的抽樣龍頭抽樣時(shí)，應(yīng)事先將龍頭消毒；　?。?）．當(dāng)用自動(dòng)抽樣器取不需要冷卻的粉狀或固定食品時(shí)，必須履行相應(yīng)的管理辦法，保證產(chǎn)品的代表性不被人為地破壞