【正文】 trol of gene expression by a lightswitchable transgene system. Nat. Methods 9, 266– 269 (20xx). 6 Polstein, . amp。 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 14 另一個原因則可能是該光控表達(dá)系統(tǒng)本身不適合在 sf9 細(xì)胞中工作。帶紅色熒光的細(xì)胞占帶色熒光細(xì)胞的比例較低，在沒有流式細(xì)胞儀的情況下，很難建立該系統(tǒng)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。送測序也符合預(yù)期。 6） 吸除轉(zhuǎn)染試劑混合液，加入 2ml sf9 細(xì)胞完全培養(yǎng)液 （含雙抗及 10％FBS）， 28℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)， 24h 后跟蹤細(xì)胞狀態(tài)。轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備 10ml 平板培養(yǎng)基： Grace 細(xì)胞培養(yǎng)液（含 10％FBS） + Grace細(xì)胞培養(yǎng)液（不含 FBS）。⑤克隆方法同上，使用的酶切位點(diǎn)為 PvuII 和 BglII。重復(fù)一次； 9） 空轉(zhuǎn)， 14000g 離心 2min； 10） 加入適量的 ddH2O 洗脫，并測定濃度。 注意：對于 PCR產(chǎn)物及 PCR片段的酶切產(chǎn)物的回收，直接加入 Binding Buffer 后，從第三步開始回收。將裝有膠塊的離心管短暫離心，依據(jù)刻度大致估算膠塊體積，加入等體積的 Binding Buffer 于 60℃溶膠，期間因上下顛倒離心管以加速溶膠； 3） 掛柱。由第二步到第四步重復(fù) 30 個循環(huán)。 20分鐘后膠塊凝固即可使用。通過分析，定性得到該光控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力。 圖 。（ a）四組細(xì)胞均被轉(zhuǎn)染 pC120Fluc，第一組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空的不含 VPEL222的質(zhì)粒，第二組轉(zhuǎn)染含 VPEL222的質(zhì)粒（ pVPEL222），第 三組細(xì)胞為 293T野生型，第四組細(xì)胞為轉(zhuǎn)染 pVPEL222后獲得穩(wěn)定表達(dá)VPEL222細(xì)胞系，四個組各自分光照和黑暗兩小組。而且，這個系統(tǒng)可以實現(xiàn)對細(xì)胞進(jìn)程的功能性調(diào)節(jié)，因為已經(jīng)證明光控調(diào)節(jié) 293T細(xì)胞的剪切作用。這些反應(yīng)在黑暗中又會反過來進(jìn)行，其逆反應(yīng)在停止藍(lán)光照射后將很快發(fā)生，這是快速去激活作用的基礎(chǔ)。光誘導(dǎo)啟動子一般都會依賴于一個光敏轉(zhuǎn)錄因子，而這類光敏轉(zhuǎn)錄因子大多是通過人工改造光敏蛋白得到。光作為光控啟動子的誘導(dǎo)因子，具有其它各種誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)條件無與倫比的優(yōu)勢。 1， 2 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 2 1）阻遏型啟動子系統(tǒng) 該系統(tǒng)建立在阻遏蛋白與轉(zhuǎn)錄因子在空間構(gòu)型相互作用的基礎(chǔ)之上。 在開發(fā)植物天然存在的誘導(dǎo)型啟動子的基礎(chǔ)上。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 III Abstract As the most bright one of the artificial induced expression system, optogeic gene expression system is being more and more popular. Light as induced factor to control gene expression has the inparable advantages over other chemical factor, such as the accurate control of time and space. In spite of this, the current main optogeic gene expression system still has many weaknesses that limit its application, such as: the toxicity of the protein itself, narrow scope of regulation, and the slow activation and deactivation, so that it is not overwhelming pared with the traditional chemical inducing expression system . Here we will show a new optogeic gene expression system, which does not has the big three shortings, and has shown a wide range of applicability. With this system, we have tested in a variety of mammalian cells to confirm whether it can drive transcription of the target gene. The method for precise control of gene expression in time and space is a powerful tool. This paper will talk about the application of this new optogeic gene expression system in sf9 insect cell . Sf9 insect cells is Spodoptera frugiperda cell . Sf9 cells is made up of . Smith and . Cherry from cell lines IPLB in 1983 SF, a clone of the 21st AE to e. IPLB SF, 21st AE is 1977 by Vaughn from ovarian tissue of meadow moth pupa. Sf9 cells belong to half adherent cell lines, which can suspension culture, and also can undertake adherent ’s application in protein expression and the preparation and purification has many advantages over others. Sf9 insect cells is a platform baculovirus expression system . Baculovirus expression system is more and more widely applied in eukaryotic expression system in recent years, which can carry a variety of foreign genes need to express in insect cells, including fungi, plants, bacteria, virus genes. Baculovirus is doublestranded DNA virus,the natural reservoir of which is insect has a high degree of species specificity, it not infected vertebrates, positively harmless to human and animal. The present study is more alfalfa crazing armyworm nuclear polygonal body virus (AcMNPV). OpIE1 and OpIE2, two promoters of the vector pMIB/v5 His which we used to construct the optogeic gene expression system are early promoter of a baculovirus, and former promoter is more stronger. The baculovirus is Orgyia pseudotsugata multicapsid nuckear polyhedrosis virus (OpMNPV),the natural host of which is the Douglas fir tussock spite of this, the two promoters will still function in the sf9 cells, sf21, LD652Y and other insects to the drive gene expression. Baculovirus early promoter can drive gene expression of cells in the absence of viral factors . So to some extent, the pMIB vector we used also has the advantages that baculovirus expression vector has. Such as: 1) Folding correctly of rebinant protein , and the formation of disulfide bond。如： 1）表達(dá)的重組蛋白能正確折疊 ，并形成二硫鍵； 2） 翻譯后可進(jìn)行修飾加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信號肽切割等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白； 3） 與其他基于 sf9昆蟲細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 II 真核表達(dá)系統(tǒng)相比， 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以高效表達(dá)外源基因，表達(dá)量最高可達(dá)被感染 昆蟲細(xì)胞總蛋白量的 5 0 ％； 4）可以容納大片段外源基因。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (baculovirus expression system)是近年來應(yīng)用較多的真核表達(dá)系統(tǒng)，它可以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)多種外源基因，包括真菌，植物，細(xì)菌，病毒的基因。 通過這個系統(tǒng)，我們在多種哺乳動物細(xì)胞中測試了光控轉(zhuǎn)錄作用。光作為誘導(dǎo)因子控制基因表達(dá)比其它化學(xué)因子具有無可比擬的優(yōu)勢，如對時間和空間上的精確把握。 IPLBSF 21 AE是 1977年由 Vaughn等從草地夜蛾蛹的卵巢組織得到 的。盡管如此，這兩個啟動子仍然能夠在 sf9細(xì)胞、 sf2 LD652Y等多種昆蟲細(xì)胞中驅(qū)動基因表達(dá)。 這個系統(tǒng)作為人工控制基因表達(dá)系統(tǒng)家族中的最有潛力的系統(tǒng)之一，具有足夠的優(yōu)勢，有望在生命科學(xué)各個領(lǐng)域發(fā)揮作用，這里對它的應(yīng)用只是一個很小的方面，它本身的應(yīng)用并不僅限于昆蟲細(xì)胞，對很多脊椎動物細(xì)胞都適用。長期進(jìn)化過程中，生物通過啟動不同 基因 的表達(dá)可在一定范圍內(nèi)適應(yīng)光、溫、水等環(huán)境的變化。 一個理想的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)具備以下特點(diǎn)：首先，外源基因在植物體自身不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)添加誘導(dǎo) 物后，高效誘導(dǎo)基因表達(dá)；其次，誘導(dǎo)物需要有較強(qiáng)的專一性；第三，誘導(dǎo)物可快速啟動基因表達(dá)的“開”與“關(guān)”；而且誘導(dǎo)物對植物無毒 或低毒。 光誘導(dǎo)啟動子 人工誘導(dǎo) 型還有一顆新星，光誘導(dǎo)表達(dá)啟動子，簡稱光控啟動子。當(dāng)前已被開發(fā)出來的光控啟動子華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 3 大多有一個共同的缺點(diǎn)：對目標(biāo)基因表達(dá)量的調(diào)控范圍較窄。 這個系統(tǒng)的光依賴轉(zhuǎn)錄激活作 用只需少量元件，一個光敏結(jié)構(gòu)域 LOV11，一個螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋（ HTH） DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過這個方法，在 293T細(xì)胞中應(yīng)用這個系統(tǒng)已被證明了富集倍數(shù)超過 200 的過表達(dá)。對比光照和黑暗