【正文】 ， VPEL222 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)入與否，從圖中可以很清晰地看到 VPEL222系統(tǒng)在 293T細(xì)胞中工作效率很高。初始載體圖譜（圖 2.）。特別是當(dāng)我們的目的蛋白是作為功能蛋白時，此時對該蛋白的實(shí)時表達(dá)控制，即是對一個代謝通路的調(diào)節(jié)與控制。 II、核酸電泳所用溶液 TAE buffer (50 ) Tris 242 g Na2EDTA?2H2O g M EDTA () 20 mL 加入 800 mL 雙蒸水，加熱溶解后，加入 mL 的冰醋酸，補(bǔ)水定容至 1000 mL，常溫保存?zhèn)溆?，配膠及做為電泳液前先稀釋至 1 后再使用。質(zhì)粒需保存在 20℃。帶上相關(guān)防護(hù)用具后，在紫外線下切取目的條帶。 13000g 2min離心，除去殘留的 Washing Buffer； 6） 洗脫。 轉(zhuǎn)化的步驟 本實(shí)驗(yàn)中，所有的轉(zhuǎn)化均是轉(zhuǎn)化大腸桿菌 1） 取感受態(tài) DH5α于冰上； 2） 待感受態(tài)細(xì)胞融化后加入已經(jīng)連接過夜的連接產(chǎn)物，輕輕混合均勻； 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 10 3） 放置冰上 30min以上； 4） 立刻于 42℃熱激 90s； 5） 熱激完畢立刻置于冰上 2min； 6） 加入 500ml無抗生素的 LB培養(yǎng)基，搖菌 1h； 7） 涂平板（本實(shí)驗(yàn)使用的都是 Amp抗性）。③方法同上，使用的酶切位點(diǎn)為 SpeI 和 AgeI。 圖 。稀釋 13μg目標(biāo)質(zhì)粒于 100μl Grace’s 培養(yǎng)基。圖中，中間條帶為 marker 條帶，從上到下依次代表： 8k、5k、 3k、 2k、 1k、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp。 3） ①號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 sf9 后，設(shè)置藍(lán)光照射與黑暗條件培養(yǎng)兩組，轉(zhuǎn)染 24 小時后施與光照（藍(lán)光照射 10s停 10s為一個循環(huán)）與黑暗兩種條件，光照 48小時后于熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果（圖 5(c)）。因此可能是由于這一機(jī)制在 sf9 細(xì)胞中出現(xiàn)問題，或是其它相關(guān)原因?qū)е?VPEL222 的表達(dá)量不及預(yù)期，導(dǎo)致紅色熒光細(xì)胞占綠色熒光的細(xì)胞比例較低。 Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat. Rev. Ge. 13, 21– 35 (20xx). 3 Briggs, . amp。 Gardner, . Blue light– induced dimerization of a bacterial LOVHTH DNAbinding protein. Biochemistry 52, 6653– 6661 (20xx). 14 Laura B MottaMena,Anna Reade,Michael J Mallory,Spencer optogeic gene expression system with rapid activation and deactivation kiics. Nature chemical biology,10,196202(20xx) 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 17 致 謝 本研究是在導(dǎo)師徐富強(qiáng)研究員和博士后師兄吳陽的悉心指導(dǎo)下完成的。 蔡澤蘄 20xx年 5月 22日 。在課題的選題、實(shí)驗(yàn)的設(shè)計和論文的撰寫上傾注了大量的心血，感激之情難以言盡；師兄淵博的學(xué)識、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度、忘我投入的工作作風(fēng)和平易近人的人格魅力都深深的感染和激勵著我。 Lin, C. Optogeic control of transcription in zebrafish. PLoS ONE 7, e50738 (20xx). 5 Wang, X., Chen, X. amp。如使用其它的組成型啟動子。首先在 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體轉(zhuǎn)染結(jié)果中看，轉(zhuǎn)染效率較高（有綠色熒光的細(xì)胞較多），不過其中有紅色熒光的細(xì)胞 較少。鑒定結(jié)果符合預(yù)期，①號和③號 750bp 條帶為 mCherry帶，②號 900bp 左右條帶為EL222帶。 5） 加 210μl混合液于待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中， 28℃孵育 35h。 1） 使用標(biāo)準(zhǔn) 6 孔板傳代培養(yǎng) sf9 細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到每孔 8 105 時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。因這兩個基因?yàn)榇?lián)表達(dá)，故先通過 T 載體，將兩者克隆在一起。 1） 10000g 離心 1min搖菌過夜的菌液，去上清； 2） 加入 solutionI 250ml重懸菌體； 3） 加入 solutionII 250ml破碎菌體，上下顛倒數(shù)次混勻，不可劇烈震蕩以免因剪切力撕裂基因組 DNA； 4） 靜置 2min后加入 solutionIII 300ml沉淀雜質(zhì)，上下顛倒混勻數(shù)次； 5） 15000g離心 10min； 6） 取上清于提供的柱子中， 10000g 離心 1min，去濾液； 7） 加入 500ml Buffer DEA， 10000g 離心 1min，去濾液； 8） 加入 700ml Washing Buffer 10000g 離心 1min，去濾液。利用 Nanodrop 20xx測定 DNA濃度。如條件允許，最好在把膠塊放在玻璃上以減少紫外線的損傷，或使用長波紫外線，或使用其它的 DNA染色方法； 2） 溶膠。第四步延伸時間根據(jù)片段長度確定，約 1kb/min。 IV、瓊脂糖膠的制備 使用電泳緩沖液 TAE制備 ％的瓊脂糖膠，微波爐加熱 24分鐘，溶液澄清透明后停止加熱，自然冷卻后倒入膠模。首先我們需要測試該系統(tǒng)是否能移植到 sf9 細(xì)胞中，以及其在sf9 細(xì)胞中的穩(wěn)定性，我們采用 mCherry 紅色熒光蛋白基因作為報告基因。也切掉了 OpIE2啟動子，詳細(xì)構(gòu)建步驟后面會說明。 圖 293T細(xì)胞中的表現(xiàn)。這個系統(tǒng)有快速的激活（ 10s）和去激活能力（ 50s），這與另一種同樣以LOV 為基礎(chǔ)的光控系統(tǒng)形成鮮明對比，該系統(tǒng)的去激活能力 小于 2 小時。藍(lán)光照射會觸發(fā)光化學(xué)反應(yīng)： LOV 結(jié)構(gòu)域中的黃素蛋白復(fù)合物打斷了 LOV 和HTH 的相互作用，使 EL222 二聚化，從而發(fā)揮 DNA 結(jié)合蛋白活性 12， 13。本文將講述的一個光控表達(dá)系統(tǒng)一定程度上相對 其它光控系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢。 光控啟動子，由于其在時間和空間上對基因表達(dá)高精度的控制性而很受很多領(lǐng)域研究的歡迎。 人工誘導(dǎo)啟動子使人為控制基因表達(dá)成為可能。由于生物生長環(huán)境及基因表達(dá)的復(fù)雜性，從外界環(huán)境的刺激到啟動應(yīng)答基因的表達(dá)之間的信號通路往往是相互交 叉的，這樣啟動子中包含的順式作用元件通常也不止一種。 關(guān)鍵詞：桿狀病毒表達(dá)載體、光控表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞 。因此從某種程度上說，桿狀病毒表達(dá)載體所具有的優(yōu)點(diǎn)，我們使用的 pMIB載體也同樣具有。 Sf9昆蟲細(xì)胞是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的平臺。在我們這里將展示一個新的光控表達(dá)系統(tǒng)，它沒有前述三大缺點(diǎn)，且已被證明廣泛的適用性。盡管如此，當(dāng)前主要的光控表達(dá)系統(tǒng)仍有很多弱點(diǎn)限制著它的應(yīng)用，比如：蛋白本身的毒性、狹窄的調(diào)控范圍以及反應(yīng)緩慢的激活和去激活作用，相比傳統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) 沒有壓倒性優(yōu)勢。 sf9細(xì)胞屬于半貼壁型細(xì)胞系，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，也可以進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，在應(yīng)用于蛋白的表達(dá)與制備純化中，有著許多的優(yōu)點(diǎn)。桿狀病毒早期啟動子可以在沒有病毒因素的情況下利用細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)制驅(qū)動基因表達(dá)。此次在昆蟲細(xì)胞中對該系統(tǒng)的實(shí)踐則是首次。這些 基因 的啟動子通常包含比較保守的 順式作用元件 ，利用這些保守元件可以推 測新基因的可能功能，也可用這些環(huán)境應(yīng)答基因的啟動子與抗逆 基因融合 ，從而使轉(zhuǎn)基因生物更好地適應(yīng)逆境。根據(jù)控制基因表達(dá)的方式，可將化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)分 為兩大類：阻遏型啟動子系統(tǒng)和激活型啟動子系統(tǒng)。 光控表達(dá)系統(tǒng)可以在空間和時間上精確控制轉(zhuǎn)錄，這和很多傳統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)啟動子不一樣 3。如能在此方面有重大突破，將帶來光遺傳學(xué)的一場革命。黑暗時 LOV 結(jié)構(gòu)域結(jié)合者HTH 結(jié)構(gòu)域，覆蓋了對于成為二聚體而結(jié)合到 DNA 所必需的 HTH4α位點(diǎn)。與之對照，在最小泄露的非誘導(dǎo)條件下，黑暗條件和紅光照射富集倍數(shù)只能有小于 2 的改變。該實(shí)驗(yàn)中使用的報告基因是螢火蟲熒光素酶基因，通過該酶的活性測定獲得該基因的表達(dá)活性 14。該載體通常只用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白，在其上的多克隆位點(diǎn)中可以很容易插入一段外源序列，而此次我們需要其表達(dá)三個外源蛋白： mCherry 紅色熒光蛋白、 EL222轉(zhuǎn)錄因子、 GFP 綠色熒光蛋白，所以，我們采取讓后兩者串聯(lián)表達(dá)的方案（使用 2A自剪切多肽）。本實(shí)驗(yàn)中在 sf9 細(xì)胞中建立的光控表達(dá)系 統(tǒng)，已有報道在 293T 細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)成功，也可以說，這個系統(tǒng)是最初從 293T 細(xì)胞中建立起來的 14，我們所做的工作是把該系統(tǒng)移植到基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 6 sf9 細(xì)胞中來。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 7 III、溴化乙錠 (EB)溶液母液 配制終濃度為 10 mg/mL 的 EB 溶液，并室溫保存在棕色瓶子。 通用 PCR體系及程序 鑒定性質(zhì)的菌液 PCR及質(zhì)粒 PCR在本實(shí)驗(yàn)中皆使用同一種 PCR體系： 模板 1μl 引物 F 1μl 引物 R 1μl dNTPs 10xBuffer 2μl EasyTaq ddH2O Total 20μl PCR 程序： 1） 95℃ 5min； 2) 95℃ 30s； 3) 60℃ 30s； 4) 72℃ ； 5）72℃ 10min。盡可能快，避免紫外線對 DNA 的損傷（控制在 10s 以內(nèi)）；盡可能不切多余的膠塊。根據(jù)預(yù)估 DNA量加入適量 60℃溫水（一般 30μl）， 12min后 120xxg 2min離心洗脫 DNA； 7） 濃度測定。 質(zhì)粒抽提試劑盒的使用 本次實(shí)驗(yàn)中使用 的質(zhì)粒抽提試劑盒都是同一規(guī)格。④其中 GFP 基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室自有，通過 NheI 酶切位點(diǎn)（事先設(shè)計含有 NheI 位點(diǎn)的 GFP 引物）放進(jìn) T 載中；而 VPEL222 則通過BsiwI 位點(diǎn)放進(jìn)同一個 T 載中；這 兩步克隆中，均需使用 CIP 堿性磷酸酶，均包含插入序列的正反鑒定。 本次實(shí)驗(yàn)需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒有兩個： pMIBC120mCherryGFPEL222（以下簡稱為①號）、 pMIBC120mCherryGFP（以下簡稱為②號）。 4） 將稀釋后的 DNA和轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，室溫孵育 1530min。①號和②號分別為 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體的 AgeI/SpeI 和 BsiwI 的酶切條帶；③號和④號分別為 pMIBC120mCherryGFP 載體的 AgeI/SpeI 和 BsiwI 的酶切條帶。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 13 從圖 5(a)的數(shù)據(jù)可以看出，該系統(tǒng)在 sf9 細(xì)胞中能初步工作，不過其工作效率較低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將繼續(xù)摸索轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件，多做幾個重復(fù)，如果得到的結(jié)果沒有預(yù)期改善，則考慮換一種方式表達(dá) EL222 蛋白。 Spudich, . Handbook of Photosensory Receptors (WileyVCH, 20xx). 4 Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S. amp。感謝徐富強(qiáng)老師和何曉斌老師給我進(jìn)入生物磁共振實(shí)驗(yàn)室學(xué)