【正文】 感謝徐富強(qiáng)老師和何曉斌老師給我進(jìn)入生物磁共振實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)的機(jī)會(huì)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將繼續(xù)摸索轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件，多做幾個(gè)重復(fù)，如果得到的結(jié)果沒有預(yù)期改善，則考慮換一種方式表達(dá) EL222 蛋白。①號(hào)和②號(hào)分別為 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體的 AgeI/SpeI 和 BsiwI 的酶切條帶；③號(hào)和④號(hào)分別為 pMIBC120mCherryGFP 載體的 AgeI/SpeI 和 BsiwI 的酶切條帶。 本次實(shí)驗(yàn)需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒有兩個(gè)： pMIBC120mCherryGFPEL222（以下簡(jiǎn)稱為①號(hào)）、 pMIBC120mCherryGFP（以下簡(jiǎn)稱為②號(hào)）。 質(zhì)粒抽提試劑盒的使用 本次實(shí)驗(yàn)中使用 的質(zhì)粒抽提試劑盒都是同一規(guī)格。盡可能快，避免紫外線對(duì) DNA 的損傷（控制在 10s 以內(nèi)）；盡可能不切多余的膠塊。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 7 III、溴化乙錠 (EB)溶液母液 配制終濃度為 10 mg/mL 的 EB 溶液，并室溫保存在棕色瓶子。該載體通常只用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白，在其上的多克隆位點(diǎn)中可以很容易插入一段外源序列，而此次我們需要其表達(dá)三個(gè)外源蛋白： mCherry 紅色熒光蛋白、 EL222轉(zhuǎn)錄因子、 GFP 綠色熒光蛋白，所以，我們采取讓后兩者串聯(lián)表達(dá)的方案（使用 2A自剪切多肽）。與之對(duì)照，在最小泄露的非誘導(dǎo)條件下，黑暗條件和紅光照射富集倍數(shù)只能有小于 2 的改變。如能在此方面有重大突破，將帶來(lái)光遺傳學(xué)的一場(chǎng)革命。根據(jù)控制基因表達(dá)的方式，可將化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)分 為兩大類：阻遏型啟動(dòng)子系統(tǒng)和激活型啟動(dòng)子系統(tǒng)。此次在昆蟲細(xì)胞中對(duì)該系統(tǒng)的實(shí)踐則是首次。 sf9細(xì)胞屬于半貼壁型細(xì)胞系，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，也可以進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，在應(yīng)用于蛋白的表達(dá)與制備純化中，有著許多的優(yōu)點(diǎn)。在我們這里將展示一個(gè)新的光控表達(dá)系統(tǒng)，它沒有前述三大缺點(diǎn)，且已被證明廣泛的適用性。因此從某種程度上說(shuō)，桿狀病毒表達(dá)載體所具有的優(yōu)點(diǎn)，我們使用的 pMIB載體也同樣具有。由于生物生長(zhǎng)環(huán)境及基因表達(dá)的復(fù)雜性，從外界環(huán)境的刺激到啟動(dòng)應(yīng)答基因的表達(dá)之間的信號(hào)通路往往是相互交 叉的，這樣啟動(dòng)子中包含的順式作用元件通常也不止一種。 光控啟動(dòng)子，由于其在時(shí)間和空間上對(duì)基因表達(dá)高精度的控制性而很受很多領(lǐng)域研究的歡迎。藍(lán)光照射會(huì)觸發(fā)光化學(xué)反應(yīng)： LOV 結(jié)構(gòu)域中的黃素蛋白復(fù)合物打斷了 LOV 和HTH 的相互作用，使 EL222 二聚化，從而發(fā)揮 DNA 結(jié)合蛋白活性 12， 13。 圖 293T細(xì)胞中的表現(xiàn)。首先我們需要測(cè)試該系統(tǒng)是否能移植到 sf9 細(xì)胞中，以及其在sf9 細(xì)胞中的穩(wěn)定性，我們采用 mCherry 紅色熒光蛋白基因作為報(bào)告基因。第四步延伸時(shí)間根據(jù)片段長(zhǎng)度確定，約 1kb/min。利用 Nanodrop 20xx測(cè)定 DNA濃度。因這兩個(gè)基因?yàn)榇?lián)表達(dá)，故先通過 T 載體，將兩者克隆在一起。 5） 加 210μl混合液于待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中， 28℃孵育 35h。首先在 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體轉(zhuǎn)染結(jié)果中看，轉(zhuǎn)染效率較高（有綠色熒光的細(xì)胞較多），不過其中有紅色熒光的細(xì)胞 較少。 Lin, C. Optogeic control of transcription in zebrafish. PLoS ONE 7, e50738 (20xx). 5 Wang, X., Chen, X. amp。 蔡澤蘄 20xx年 5月 22日 。 Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat. Rev. Ge. 13, 21– 35 (20xx). 3 Briggs, . amp。 3） ①號(hào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 sf9 后，設(shè)置藍(lán)光照射與黑暗條件培養(yǎng)兩組，轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后施與光照（藍(lán)光照射 10s停 10s為一個(gè)循環(huán)）與黑暗兩種條件，光照 48小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果（圖 5(c)）。稀釋 13μg目標(biāo)質(zhì)粒于 100μl Grace’s 培養(yǎng)基。③方法同上，使用的酶切位點(diǎn)為 SpeI 和 AgeI。 13000g 2min離心，除去殘留的 Washing Buffer； 6） 洗脫。質(zhì)粒需保存在 20℃。特別是當(dāng)我們的目的蛋白是作為功能蛋白時(shí)，此時(shí)對(duì)該蛋白的實(shí)時(shí)表達(dá)控制，即是對(duì)一個(gè)代謝通路的調(diào)節(jié)與控制。對(duì)比光照和黑暗， VPEL222 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)入與否，從圖中可以很清晰地看到 VPEL222系統(tǒng)在 293T細(xì)胞中工作效率很高。 這個(gè)系統(tǒng)的光依賴轉(zhuǎn)錄激活作 用只需少量元件，一個(gè)光敏結(jié)構(gòu)域 LOV11，一個(gè)螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋（ HTH） DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 光誘導(dǎo)啟動(dòng)子 人工誘導(dǎo) 型還有一顆新星，光誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子，簡(jiǎn)稱光控啟動(dòng)子。長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，生物通過啟動(dòng)不同 基因 的表達(dá)可在一定范圍內(nèi)適應(yīng)光、溫、水等環(huán)境的變化。盡管如此，這兩個(gè)啟動(dòng)子仍然能夠在 sf9細(xì)胞、 sf2 LD652Y等多種昆蟲細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。光作為誘導(dǎo)因子控制基因表達(dá)比其它化學(xué)因子具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，如對(duì)時(shí)間和空間上的精確把握。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (baculovirus expression system)是近年來(lái)應(yīng)用較多的真核表達(dá)系統(tǒng)，它可以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)多種外源基因，包括真菌，植物，細(xì)菌，病毒的基因。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 III Abstract As the most bright one of the artificial induced expression system, optogeic gene expression system is being more and more popular. Light as induced factor to control gene expression has the inparable advantages over other chemical factor, such as the accurate control of time and space. In spite of this, the current main optogeic gene expression system still has many weaknesses that limit its application, such as: the toxicity of the protein itself, narrow scope of regulation, and the slow activation and deactivation, so that it is not overwhelming pared with the traditional chemical inducing expression system . Here we will show a new optogeic gene expression system, which does not has the big three shortings, and has shown a wide range of applicability. With this system, we have tested in a variety of mammalian cells to confirm whether it can drive transcription of the target gene. The method for precise control of gene expression in time and space is a powerful tool. This paper will talk about the application of this new optogeic gene expression system in sf9 insect cell . Sf9 insect cells is Spodoptera frugiperda cell . Sf9 cells is made up of . Smith and . Cherry from cell lines IPLB in 1983 SF, a clone of the 21st AE to e. IPLB SF, 21st AE is 1977 by Vaughn from ovarian tissue of meadow moth pupa. Sf9 cells belong to half adherent cell lines, which can suspension culture, and also can undertake adherent ’s application in protein expression and the preparation and purification has many advantages over others. Sf9 insect cells is a platform baculovirus expression system . Baculovirus expression system is more and more widely applied in eukaryotic expression system in recent years, which can carry a variety of foreign genes need to express in insect cells, including fungi, plants, bacteria, virus genes. Baculovirus is doublestranded DNA virus,the natural reservoir of which is insect has a high degree of species specificity, it not infected vertebrates, positively harmless to human and animal. The present study is more alfalfa crazing armyworm nuclear polygonal body virus (AcMNPV). OpIE1 and OpIE2, two promoters of the vector pMIB/v5 His which we used to construct the optogeic gene expression system are early promoter of a baculovirus, and former promoter is more stronger. The baculovirus is Orgyia pseudotsugata multicapsid nuckear polyhedrosis virus (OpMNPV),the natural host of which is the Douglas fir tussock spite of this, the two promoters will still function in the sf9 cells, sf21, LD652Y and other insects to the drive gene expression. Baculovirus early promoter can dr