【正文】 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 109 個 原生質(zhì)體 50 ng DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 105 106 / mg DNA lDNA轉(zhuǎn)染 107 108 / mg DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化 106 109 / mg DNA 3. 轉(zhuǎn)化細胞的擴增 （ 1）擴增操作 轉(zhuǎn)化細胞的擴增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細胞的短時間培養(yǎng)。 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 539。 C 539。 539。 539。 G 539。 AAAAAAAAAAC 539。 G G 539。 539。 GCATG 339。 GAATT CTTAA 539。 G CTTAA 539。 C G 539。 CTGCA G 539。 T ACTAG 539。 GATCA T 539。 539。 AATTC G 539?；蚬こ? 第十三章 基因工程的操作過程 第十三章 基因工程的操作過程 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 二、 重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增） 一、 DNA的體外重組（切、接） 第十三章 基因工程的操作過程 切 接 轉(zhuǎn) 增 檢 一、 DNA的體外重組（切與接） 第十三章 基因工程的操作過程 同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 不同粘性末端的連接 粘性末端的更換 人工粘性末端的連接 重組率 539。 退火 G CTTAA AATTC G 539。 GAATTC CTTAAG 2. 同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 BamHI 539。 退火 G CCTAG GATCC G 539。 GATCA T TGATCC ACTAGG 539。 G ACGTC 339。 G C Klenow 補平 539。 539。 539。 C 539。 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 539。 G 339。 539。 G CCTAG 539。 EcoR I GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker 6. 重組率 （ 1）重組率的定義 重組率 = 含有外源 DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) 在常規(guī)實驗條件下 ， 重組率一般為 25 75% 重組率是衡量連接反應效率的重要指標 ， 較高的重組率可以 大大簡化 DNA重組的后續(xù)操作 。 AATTC G 539。 C 339。 539。在實驗時，擴增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導轉(zhuǎn)化后的 37℃ 培養(yǎng)一個小時 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程 l噬菌體轉(zhuǎn)染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴增操作 3. 轉(zhuǎn)化細胞的擴增 （ 2）擴增操作的目的 增殖轉(zhuǎn)化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細胞用于篩選程序 擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選 表達外源基因，便于篩選和鑒定 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 （一）載體遺傳標記檢測 （二）克隆 DNA序列檢測 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子 轉(zhuǎn)化子 重組子 目的重組子 （一） 載體遺傳標記檢測 抗藥性篩選法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r （ 1）抗藥性篩選法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗藥性篩選法可區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與 非轉(zhuǎn)化子、重組子 與 非重組子 將外源 DNA片段插在 EcoRI位點： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcr 將外源 DNA片段插在 BamHI位點： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcs （ 2）抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉(zhuǎn)化液涂布含有 Ap的平板 再將 Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至 含有 Ap和 Tc的平板上 在 Ap平板上生長、但在 Ap和 Tc平板上 不長的轉(zhuǎn)化子即為 重組子 Ap Ap + Tc 影印 挑選 （一） 載體遺傳標記檢測 營養(yǎng)缺陷型篩選法 （ 1）營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理： 營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與 非轉(zhuǎn)化子 ，一般不能區(qū)分 重組子 與 非重組子 。CTTGACTAAATCCGA DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標記： 介導的缺刻前移標記 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a32PdATP） 5‘ … GCTC AGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ DNase I DNA pol I （二） 克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標記： d. ABC熒光標記 GCTTGAGCAGTAACCTG 熒光胺 Bioti