基因工程第三章2-jun-finalversion(完整版)
【正文】 13mp2的EcoRI位點上，就產(chǎn)生了 M13mp7。分子量小，可包裝 3045kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構(gòu)建基因文庫。插入基因經(jīng)包裝后，可通過藍(lán) /白斑篩選陽性克隆。宿主含 lacZ的琥珀突變? 轉(zhuǎn)染 ：由宿主細(xì)胞捕獲噬菌體或病毒 DNA的過程。 – 不再需要標(biāo)記基因，因為空載的載體 DNA只有 26kb，不可能被包裝，因而無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去 2. λ 噬菌體的改造3) 引入無義突變– 琥珀型突變（ sup)是指由 CAG（ Gln）向 UAG（ stop）的突變。切除必需的的 RE識別位點，在非必需區(qū)引入合適的RE識別位點216。– cI基因表達(dá) ，合成參與溶菌周期活動的所有基因被阻遏的蛋白質(zhì)。l Q(晚期調(diào)控 )促頭 ,尾 ,S,R基因表達(dá)和溶菌l CI,CII,CIII為負(fù)調(diào)控，阻止溶菌環(huán)化后的 λ 基因組 DNA? 人為將 λ 噬菌體基因組分為 3個區(qū)域 ：– 左側(cè)區(qū) ：自基因 A到基因 J，包含外殼蛋白的全部編碼基因?；蚩寺≥d體基因克隆載體l 第一節(jié) 噬菌體載體? 一、噬菌體的一般生物學(xué)特性? 二、 λ 噬菌體載體? 三、粘性質(zhì)粒? 四、單鏈 DNA噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學(xué)特性 噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的 “ 寄生蟲 ” 。– 晚期： 控制滾環(huán)型復(fù)制的開關(guān)被啟動，復(fù)制從θ 型轉(zhuǎn)變?yōu)闈L環(huán)型復(fù)制，合成出一系列 λDNA線性排列的多聚體分子。– 包裝限制 : λ 噬菌體頭部只能容納自身 DNA的 75105%，即 Kb，天然 λ 僅可插入 源 DNA片段 — 如若除去所有與 λ 裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入 22 Kb。– 自然選擇法可以利用一個產(chǎn)生 EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細(xì)胞的 λ DNA 分子會被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其 EcoRI位點缺失了。含有完整標(biāo)記基因的 l載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， l重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑體外包裝體外包裝體外包裝體外包裝插入片段插入片段最小裝載長度最小裝載長度 10 kb（（ 51 – 26））載體長度載體長度 26 kb插入片段插入片段最大裝載長度最大裝載長度 25 kb（（ 36 – 26））? lDNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建： 縮短長度縮短長度 取代型載體取代型載體替換型載體的篩選 替換型載體的基因組中具有成對的限制酶位點，在這兩個位點之間的 DNA區(qū)段可以被插入的外源 DNA片段所取代cos位點 cos位點置換區(qū)域左臂 右臂λNM781 由于 λ 噬菌體的感染，寄主細(xì)胞 lacZ基因的琥珀突變被抑制 ,所以能在乳糖麥康基氏 (McConkey)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生紅色的噬菌斑 ,或是在Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色的噬菌斑。λDNA 的體外包裝? 凱倫噬菌體載體 (Charon) ? 這類載體有插入型的，如 Charon2；也有替換型的，如Charon30。 粘性質(zhì)粒（ Cosmid）帶有λ 噬菌體的 Cos位點和整個pBR322的 DNA順序。M13mp1載體不含有任何的單一切點的的識別序列，在基因的起始端，加入含有 6堿基的序列 GAATTC，是一個 EcoRI位點，這是通過體外定點突變獲得的，產(chǎn)生了 M13mp2。(termination28563194VII可應(yīng)用于克隆基因，測序，基因突變的誘變技術(shù)。整合型 附加體型 復(fù)制型根據(jù) 復(fù)制方式 不同，載體分為三種類型整合型載體（ YIP）? YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的 DNA片段構(gòu)成的。缺點 : 在受體細(xì)胞中不穩(wěn)定，易丟失。利用2181。? 受納細(xì)胞（ permissive cell）：感染病毒后能使細(xì)胞裂解釋放感染性病毒顆粒。病毒的基因組隨后就整合到宿主的染色體基因組上。重組體病毒能提供此種 T抗原， tsA58則可以復(fù)制，并合成出外殼蛋白質(zhì)，這樣就能在受納細(xì)胞中擴(kuò)增表達(dá)。這種載體 只能在持久的表達(dá)病毒 T抗原的特殊細(xì)胞系使用 ，比如 Cos細(xì)胞， HFs細(xì)胞。 11 三月 20238:42:03 下午 20:42:03三月 21? 1比不了得就不比，得不到的就不要。 20:42:0320:42:0320:42Thursday, March 11, 2023? 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 20:42:0320:42:0320:423/11/2023 8:42:03 PM? 1越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。 8:42:03 下午 8:42 下午 20:42:03三月 21MOMODAelit.fringilla感謝您的下載觀看專 家告 訴。Nullaidipsum 20:42:0320:42:0320:42Thursday, March 11, 2023? 1知人者智，自知者明。 11 三月 20238:42:03 下午 20:42:03三月 21? 1楚塞三湘接，荊門九派通。 三月 218:42 下午 三月 2120:42March 11, 2023? 1行動出成果，工作出財富。? 靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。 COS細(xì)胞可以提供大 T抗原，因此重組病毒在 COS細(xì)胞中能夠增殖和擴(kuò)增。優(yōu)點 :? 感染率
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