基因工程第三章2-jun-finalversion(存儲(chǔ)版)
【正文】 M13mp18/1942205500V 5. M13噬菌體載體的 優(yōu)越性– 能克隆較大的 DNA片斷，包裝容量 M13DNA的 6倍– 產(chǎn)生大量含有外源 DNA序列的單鏈 DNA分子 : M13噬菌體載體最大的優(yōu)點(diǎn)就是能使插入的外源DNA片段變成單鏈。有些還攜帶用于大腸桿菌的抗菌素抗性標(biāo)記；（ 3）含有合適的限制酶切位點(diǎn)，以便外源基因的插入。優(yōu)點(diǎn) : YRP對(duì)酵母的轉(zhuǎn)化率極高 (102103轉(zhuǎn)化子 /ug DNA)，拷貝數(shù)也高。 2181。三、動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體? ㈠ SV40病毒? ㈡ SV40病毒載體 – (1)取代型重組病毒載體? ① 晚期區(qū)段取代載體 ? ② 早期區(qū)段取代載體 – (2)重組的病毒 質(zhì)粒載體 猿猴空泡病毒 (SV40病毒 ) ? SV40病毒呈小型 20面體，共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA，序列已知。? 晚期表達(dá)區(qū)合成 VpVp Vp3，包裝釋放。但為了補(bǔ)充被取代的病毒基因組 DNA的功能，必須使用一種與之互補(bǔ)的輔助病毒。 在細(xì)菌中擴(kuò)增提取基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞 56天后可高拷貝擴(kuò)增、進(jìn)而高表達(dá)基因產(chǎn)物。 20:42:0320:42:0320:42Thursday, March 11, 2023? 1乍見(jiàn)翻疑夢(mèng)，相悲各問(wèn)年。 20:42:0320:42:0320:423/11/2023 8:42:03 PM? 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 8:42:03 下午 8:42 下午 20:42:03三月 21? 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 三月 218:42 下午 三月 2120:42March 11, 2023? 1業(yè)余生活要有意義，不要越軌。consecteturnullauttemporblandit,sit 三月 21三月 2120:42:0320:42:03March 11, 2023? 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 三月 218:42 下午 三月 2120:42March 11, 2023? 1少年十五二十時(shí)，步行奪得胡馬騎。 8:42:03 下午 8:42 下午 20:42:03三月 21? 沒(méi)有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。 20:42:0320:42:0320:423/11/2023 8:42:03 PM? 1以我獨(dú)沈久，愧君相見(jiàn)頻。這類質(zhì)粒既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，所以也叫 穿梭載體 ，如 pAC10。SV40的衍生物作為載體的優(yōu)缺點(diǎn)(1)取代型重組病毒載體 ? 取代型的重組病毒載體（ rebinant Virus Vector） ,其特點(diǎn)是外源 DNA直接插入在缺陷型的病毒基因組上。 T抗原的功能是控制 SV40基因組的復(fù)制和調(diào)節(jié)。? YEP型載體對(duì)酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性 ，一般為 103105轉(zhuǎn)化子 /微克DNA。m質(zhì)粒是釀酒酵母中含有的長(zhǎng)度為 2181。因?yàn)樗瑫r(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制。這樣可使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增；（ 2）含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記。496831M13mp186849831III 4. M13噬菌體載體的構(gòu)建Coordinates組成 ：質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)，抗藥基因，多克隆位點(diǎn)，已連接入的 λcos 位點(diǎn)。? Charon載體的特點(diǎn)是容量大，對(duì)研究大范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)很有用處。? 轉(zhuǎn)導(dǎo) ：以噬菌體為媒介轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的過(guò)程。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正 tRNA能專一性地糾正這一突變。引入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記基因以便重組子的篩選 216。– 附著位點(diǎn) att，同大腸桿菌染色體 DNA的局部同源位點(diǎn)之間的 重組 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。– 中間區(qū) ：介于基因 J和基因 N之間，這個(gè)區(qū)又稱為非必需區(qū)，與噬菌斑形成無(wú)關(guān)，被外源DNA片斷取代后，并不影響噬菌體的生命活動(dòng)。 噬菌體載體l 第三節(jié) 真核細(xì)胞的克隆載體第二節(jié) ? 裂解周期– 早期： 環(huán)狀的 λDNA 分子按 θ 型雙向復(fù)制，復(fù)制起點(diǎn)位于 O基因內(nèi)，需要 O、 P基因編碼蛋白的參與。4. λ 噬菌體的組裝1. 野生型的 λ 噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因– λDNA 基因組中同一種限制酶具有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，不利于外源 DNA插入 — 體內(nèi)突變和建立新的克隆位點(diǎn)。– 一般利用 自然選擇法 獲得限制性位點(diǎn)缺失的λ 品系。2. λ 噬菌體的改造3. 常用的 λ 噬菌體衍生載體載體名稱 分子大小 (kb) 可克隆外源 DNA片段大小 (kb) Charon 3A 0 – Charon 4A 0 – Charon 17 0 Charon 20 0 – Charon 21 A 0 – Charon 28 0 – Charon 30 0 LA 7 –1 0 – Sep6lac 5 0 – BF 101 46 .0 – ? 插入型載體– 只具有一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)
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