【正文】 （SOD）活性的測定儀器與用具：高速離心機；分光光度計；熒光燈（反應(yīng)試管處光照強度為4000lx）試管數(shù)支；比色皿。蒽酮比色法原理：糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。記錄重量（W）。L1)、 S2 (200 g隨后放入不同溫度條件下進(jìn)行低溫脅迫?；|(zhì)用草炭：珍珠巖：蛭石（體積比2:1:1），盆底部放置托盤。一般來說，溫度愈低，低溫持續(xù)時間愈長，溫度回升的越急劇，則寒害也越嚴(yán)重。因此引種栽培大葉冬青具有很高的生態(tài)、經(jīng)濟和社會效益。全炳武等（2008）研究濱麥在PEG6000脅迫下結(jié)果表明保護(hù)酶活性在輕度脅迫下升高，而中度或重度脅迫下活性降低或不變?？灼G菊（2006）在研究干旱脅迫對黃櫨幼苗的生理指標(biāo)影響結(jié)果表明，多數(shù)情況下黃櫨處理的葉綠素a/ b要高于對照，隨著干旱脅迫程度的加劇和時間的延長，黃櫨的葉綠素含量都有上升趨勢。干旱引起植物水分脅迫，從而對植物的生長、呼吸作用、氣孔運動、光合作用、營養(yǎng)代謝激素調(diào)節(jié)和滲透等產(chǎn)生不良影響，進(jìn)一步影響植物的生長發(fā)育。目前，植物抗旱性的研究方法有多種，大多是在人工控制的干旱或人工模擬干旱條件下進(jìn)行?！≈参锖乃笥谖畷r，植物體內(nèi)即出現(xiàn)水分虧缺，水分過度虧缺的現(xiàn)象稱為干旱（李合生，2006）。試驗中，隨著低溫傷寒程度的發(fā)展，細(xì)胞的SOD活性出現(xiàn)遞減的降低，耐寒力較強的細(xì)葉結(jié)縷草SOD活力的下降值小于耐寒力較弱的假儉草和地毯草，表明植物細(xì)胞中的SOD活性降低與細(xì)胞膜的損傷有一定的關(guān)系。馬艷青等(2000)對辣椒抗寒性進(jìn)行研究的時候發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后各品種的辣椒其MDA含量都得到了不同程度的增加，并且增加的程度與不同品種辣椒的抗寒性有關(guān)，抗寒性強的其MDA含量增加的少，抗旱性弱的增加的多。魏臻武等根據(jù)抗寒鍛煉期間草坪草葉片電解質(zhì)透過率配合Logistic方程求其拐點溫度，確定了不同類型草坪草的抗寒性。烏鳳章等（2008）在研究低溫脅迫白樺幼苗的結(jié)果顯示，在低溫脅迫下白樺幼苗高生長基本停止，葉綠素含量逐漸下降。①電導(dǎo)法。細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰傷害的主要原因是機械損傷。由于細(xì)胞外溶質(zhì)較少，冰點較高，因此在溫度降低的過程中，細(xì)胞外的水分總是先于細(xì)胞內(nèi)的水分結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分向外流，結(jié)成冰晶?；ɑ苤参镏械木栈ā⒃录?、梅花等的抗寒性研究，而對于大多數(shù)園林植物，特別是熱帶亞熱帶常闊葉植物則報道并不多見（彭筱娜，2007）。 大葉冬青的生物生態(tài)學(xué)習(xí)性 大葉冬青原產(chǎn)于我國南方中亞熱帶地區(qū)，性喜溫暖濕潤的氣候，適生涼爽的環(huán)境，深厚疏松濕潤的土壤。，隨著干旱脅迫程度的加強和時間的延長，葉片中丙二醛的含量呈上升趨勢但增幅較緩；保護(hù)酶的活性明顯增強，SOD活性表現(xiàn)為先升后降；POD活性的變化呈現(xiàn)先升后降再升再降，CAT活性呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢，這3種保護(hù)酶協(xié)同作用，有效清除自由基，減輕干旱脅迫對細(xì)胞膜的傷害，增加了大葉冬青的抗旱性，試驗說明了大葉冬青有較強的抗旱能力。從開始進(jìn)入課題到論文的順利完成，有多少可敬的師長、同學(xué)給了我無私的幫助，在這里請接受我誠摯的謝意，謝謝你們！ 夏鵬云 2010年5月目 錄摘 要 11文獻(xiàn)綜述 2 2 大葉冬青的形態(tài)特征及地理分布 2 大葉冬青的生物生態(tài)學(xué)習(xí)性 2 2 2 2。本人完全了解《河南農(nóng)業(yè)大學(xué)知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)辦法》的有關(guān)規(guī)定，在畢業(yè)離開河南農(nóng)業(yè)大學(xué)后，就在校期間從事的科研工作發(fā)表的所有論文，第一署名單位為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，試驗材料、原始數(shù)據(jù)、申報的專利等知識產(chǎn)權(quán)均歸河南農(nóng)業(yè)大學(xué)所有，否則，承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。特此聲明。在此謹(jǐn)向蘇老師致以誠摯的謝意和崇高的敬意。POD活性在兩種降溫下都低于對照。果實球形，紅色或褐色；分核4。關(guān)于植物抗性方面的研究國內(nèi)外研究者己做了大量的工作，論文和專著不勝枚舉，但大葉冬青與其他植物的研究相比尚有距離。植物體內(nèi)的甘油3磷酸?；D(zhuǎn)移酶、W3脂肪酸去飽和酶等能催化膜中脂肪酸的去飽和反應(yīng)，增加質(zhì)膜中不飽和脂肪酸的含量，從而提高了植物的抗冷性。植物細(xì)胞外水分的過冷現(xiàn)象以及過冷現(xiàn)象詳細(xì)的分子機制，目前還尚未研究清楚。第二種是組織褐變法，通過觀察未受低溫處理組織的顏色和受低溫處理組織的顏色進(jìn)行對比，確定植物受傷害的程度。 膜結(jié)構(gòu)功能的變化引起細(xì)胞代謝的改變低溫能引起一系列細(xì)胞代謝功能的改變，人們通常采用測定植物的葉綠素含量、膜透性、可溶性糖含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、CAT活性等一系列生理特性來研究植物的抗寒性。電導(dǎo)率的變化反應(yīng)出質(zhì)膜受傷害程度和所測材料的抗寒性的大小。在相同的低溫脅迫處理條件下，MDA含量高的品種抗寒性弱，反之則強?；钚匝踉诘蜏孛{迫下積累，會在植物細(xì)胞膜系統(tǒng)上誘發(fā)膜脂過氧化作用，破壞膜結(jié)構(gòu)，使膜內(nèi)物質(zhì)向外滲漏，從而使植物遭受低溫傷害。干旱由于其發(fā)生頻率高、持續(xù)時間長，影響范圍廣、后延影響大，成為影響我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最嚴(yán)重的氣象災(zāi)害之一。植物的水分虧缺是由于蒸騰失水超過吸水而產(chǎn)生的，即使在土壤水分充足的情況下，晴天的中午也常常產(chǎn)生干旱。PEG是一種較為理想的滲透調(diào)節(jié)劑，許多研究者認(rèn)為用PEG模擬植物干旱逆境是可行的（Gergely I 1980；王翠花等2005）。 干旱脅迫與植物葉綠素含量的變化葉綠素總量主要包括葉綠素a(Chla)和葉綠素b(Chlb)，葉片葉綠素含量的變化，常被用作脅迫反應(yīng)的指標(biāo)。唐連順（1994）等研究表明在干旱脅迫過程中玉米葉片質(zhì)膜透性明顯加大，且與MDA含量的變化呈顯著的正相關(guān)，這暗示膜脂過氧化增強是造成膜傷害的一個重要原因。主要分布于長江中下游各省及福建等地，河南南部大別山區(qū)有自然分布。植物的低溫危害，表現(xiàn)為冷害和凍害，冷害為0 ℃以上的低溫引起，凍害則為0 ℃以下的低溫造成。本試驗主要討論在低溫及干旱脅迫下，大葉冬青葉片的生理生化指標(biāo)的變化，為大葉冬青的引種栽培提供理論依據(jù)。不同低溫處理后的苗木立即采樣測定葉片各項生理指標(biāo)，3次重復(fù)。在6℃、0℃、6℃下，處理24h，采集成熟葉片進(jìn)行指標(biāo)測定。試驗開始后每3天取樣1次，共采樣6次。公式電導(dǎo)儀的常數(shù)：（1）檢查：調(diào)至： 常數(shù)為： 溫度： 25℃（2）測定時：先調(diào)至Ⅱ，測不出再調(diào)至Ⅲ。分別放入4支刻度試管中，加入10ml蒸餾水，用塑料薄膜封口，在沸水中提取30min，提取液過濾到25ml容量瓶中，重復(fù)提取——過濾過程一次。SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活單位表示，按下列公式計算SOD活性。=%的H2O2稀釋到250ml配置成CAT反應(yīng)液。取離心后的上清夜3ml，加入3ml ％的硫代巴比妥酸（TBA），混合后在沸水浴中煮沸30min，記錄體積（V0=6ml），冰浴下迅速冷卻，再離心10min。植株在處理前24h 葉綠素含量都始終處于下降趨勢,在第48 h時0℃、6℃葉綠素含量開始回升。大葉冬青葉片在緩慢降溫下的相對電導(dǎo)率變化如圖43 所示。此階段相對電導(dǎo)率下降可能與植物的自身調(diào)節(jié)有關(guān)。表41 不同處理時間大葉冬青半致死溫度LT50的計算Table41 LT50 of Broadleaf holly of different periods處理時間Treatment timeLogistic方程半致死溫度LT50（℃）擬合度R224 hY = / (1 + x)48 hY = 57. 465 / (1 + 69. 868 e0. 378 x) 11. 2372 hY = / (1 + x) 低溫脅迫下大葉冬青葉片MDA含量的變化 MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物,其含量的高低反映了細(xì)胞膜脂過氧化水平。表明在低溫脅迫下，膜脂過氧化作用加強，MDA含量增加。6 ℃、12 ℃、18 ℃處理下在24h時就達(dá)到了峰值，%、%、%。 圖49 驟然降溫下大葉冬青葉片可溶性糖含量的變化Fig49 Effect of rapid cooling chill stress on SS content of broadleaf holly leaves由圖49可知，驟然降溫下大葉冬青葉片可溶性糖含量變化同緩慢降溫相似，也呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢。圖10 緩慢降溫下大葉冬青葉片SOD活性的變化Fig410 Effect of rapid cooling chill stress on SOD activity of broadleaf holly leaves由圖410可知，緩慢降溫SOD酶相對活性表現(xiàn)為“先降后升”的趨勢，在處理24h時，活性達(dá)到最低，%、%、%、%。3個處理都在24h時出現(xiàn)一個峰值，%、%、%，SOD活性的增強說明超氧自由基的增加，這是植物在遭遇逆境時清除過多的活性氧進(jìn)行自保的正常反應(yīng)。0℃、6℃處理下POD活性先降后升，12℃、18℃處理下其POD活性一直處于下降趨勢。隨后持續(xù)下降，%、%、%。12℃、18 ℃處理下的CAT活性已低于對照的CAT活性。低溫脅迫第48h時，MDA與可溶性糖、SOD、POD負(fù)相關(guān)，與電導(dǎo)和CAT正相關(guān)，說明在這個過程中可溶性糖、SOD、POD的協(xié)同作用有效的保護(hù)了MDA對大葉冬青細(xì)胞膜的傷害。葉綠素含量的變化如圖51，表51所示。在S3處理下第18天大葉冬青表現(xiàn)出葉片萎蔫、卷曲，葉綠素含量明顯下降，說明大葉冬青不能忍耐過分的、長期的干旱脅迫。許多研究表明，SOD活性與植物抗氧化能力成正相關(guān)性，SOD活性的高低是植物抗旱性的重要標(biāo)志（王翠花等，2005）。過氧化物酶（POD）通過催化H2O2 與其底物反應(yīng)以消耗H2O2，減少H2O2對生物體的的傷害作用，在植物抗性中發(fā)揮重要作用。PEG脅迫下大葉冬青葉片CAT活性的變化見圖55，方差分析見表55。從第9天開始，POD活性迅速上升，到12天時3個處理均達(dá)到峰值，%，%，%。圖53 干旱脅迫下大葉冬青葉片SOD活性的變化Fig53 The activity variation of SOD on Broadleaf Holly leaf under drought stress表53不同干旱脅迫處理下大葉冬青葉片SOD活性隨時間變化的方差分析（單位：μ﹒g1FW）Table53 Different drought stress treatments Broadleaf Holly leaf SOD changes with time analysis of variance處理Treatment處理時間Treating Time0 d 3 d6 d9 d12 d15 d18 dCK 14 a13 a14 a13 a 10 a14 a13 aS1 13 a 21 a16 a 15 a 13 a 15 a14 aS2 15 a 25 ab 20 ab12 a12 a9 b12 aS3 14 a33 b24 b15 a 12 a8 b7 b由圖53可以看出，SOD的活性在3個處理下都呈先上升后下降的變化趨勢。PEG脅迫下大葉冬青葉片MDA含量的變化見圖52。g1FW）Table51 Different drought stress treatments Broadleaf Holly leaf chlorophyll content changes with time analysis of variance處理Treatment處理時間Treating Time0 d3 d6 d9 d12 d15 d18 dCK a a a a a a aS1 a b b a a a aS2 a a ab a a a abS3 a c a a a a c在防止干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。圖415 驟然降溫下大葉冬青葉片CAT活性的變化Fig415 Effect of slow cooling chill stress on SOD activity of broadleaf holly leaves由圖415 可見，驟然降溫下大葉冬青葉片CAT活性的變化與緩慢降溫的變化趨勢基本一致，隨低溫脅迫時間的延長，CAT活性先升高，再降低，且CAT一直維持較高的活性，在48h時三個處理都達(dá)到了最大值，%、%、%，48h時CAT活性最大。 低溫脅迫對大葉冬青葉片CAT活性的影響CAT是植物體內(nèi)重要的活性氧消除系統(tǒng)之一，可以清除H2O2，H2O2是植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，H2O2的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用，CAT的活性與植物的抗逆性有關(guān)。72h后，0℃、6℃有所上升，但仍低于對照。6℃處理SOD活性產(chǎn)生了不可逆的下降，表明驟然降溫下6℃處理48h已經(jīng)對大葉冬青產(chǎn)生了傷害，說明驟然降溫對植物造成的傷害更嚴(yán)重。隨后SOD活性開始上升，直至72h時，0℃、6℃%、%。隨后，三個處理都開始可溶性糖含量都開始下降，但6℃、0℃處理下大葉冬青葉片的可溶性糖含量仍高于對照。說明低溫處理提高了葉片中可溶性糖的含量，且隨低溫處理溫度越低，含量增大越快。圖47 驟然降溫下大葉冬青葉片MDA含量的變化Fig47 Effect of rapid cooling