【正文】 te PCR） LA PCR是一種專門用于精確擴(kuò)增較長(zhǎng) DNA片段的特種 PCR程 序，其關(guān)鍵的技術(shù)是結(jié)合使用兩種熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶，可以擴(kuò)增 出 5 40 kb的 DNA大片段。 延伸聚合溫度和時(shí)間 延伸聚合溫度和時(shí)間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 72 ℃ 60 120 secs PCR擴(kuò)增反應(yīng)中普遍使用的 DNA聚合酶的聚合速度每秒至少 50 個(gè)堿基，所以如果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度小于 400 bp， 聚合時(shí)間可以少 于 15秒，特別是當(dāng)退火溫度選得較高的時(shí)候，在退火階段就有一些 單體摻入。 Mg+2的濃度影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、引物退 火、引物二聚體的形成、熔點(diǎn)溫度、酶的活性和準(zhǔn)確性。在模 板量一定的情況下，降低引物濃度實(shí)際上也是降低引物與模板 的分子之比。 至少應(yīng)有 12個(gè)堿基必須是特異性的。 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 退火溫度（ Ta） 引物的退火溫度一般要比估計(jì)的相應(yīng)熔點(diǎn)溫度低 5℃ 左右，在很多 情況下，兩條引物的退火溫度不盡相同，只要兩者相差不到 46℃ ， 尚 不至于影響 RCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)量，但它們的退火溫度應(yīng)在 5575℃ 范圍 引物堿基 ≤20， Ta = 4 X（ G+C） + 2 X（ A+T） 5（ ℃ ） 內(nèi)。 UITma DNA聚合酶（ Thermotoga maritima） DNA聚合酶的使用 DNA聚合酶的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 1 5 Units / mL 特異性的改進(jìn)： 在建議使用的范圍內(nèi)盡可能地降低酶濃度。然而通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，可使 Taq酶的 聚合出錯(cuò)率降低到原來(lái)的 1/3。5 2 3 4 1 6 7 8 PCR的原理與反應(yīng)條件 PCR的 DNA聚合酶與擴(kuò)增的精確性 PCR的模板及制備 PCR的引物設(shè)計(jì)及合成 PCR反應(yīng)的其它控制參數(shù) PCR技術(shù)的衍生與發(fā)展 PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用 PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 1 PCR的原理與反應(yīng)條件 PCR技術(shù)的反應(yīng)條件 PCR技術(shù)的基本原理 PCR反應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo) PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 聚合酶鏈反應(yīng) （ Polymerase Chain Reaction， PCR ） 又稱為 PCR 擴(kuò)增技術(shù) ，是一種高效、快速、特異性的體外 DNA聚合程序。 Taq DNA聚合 酶催化的聚合反應(yīng)的普遍 則 Taq DNA酶還常常導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失突變。 聚合酶的濃度是決定 PCR反應(yīng)成本的 的重要參數(shù)，濃度 過(guò)高不僅能降特異性，同時(shí)也導(dǎo)致不必要的消耗。如果兩條引物的退火溫度差別過(guò)大，可以適當(dāng)延長(zhǎng) 較低 Ta值 的引 物的 3’ 端（這樣可以保持?jǐn)U增產(chǎn)物的長(zhǎng)度不變）或 5’ 端。 引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡(jiǎn)介 The Primer Generator（ TPG） TPG是一種基于 CGI數(shù)據(jù)庫(kù)便利的用于定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)工具。 對(duì)的堿基，則適當(dāng)降低引物的濃度。因此， PCR反應(yīng)系統(tǒng)的 主要優(yōu)化參數(shù) 是 Mg+2的濃度，尤其當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物大 大于 1kb時(shí)，這個(gè)因素顯得更為重要。較長(zhǎng) PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增需要相應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，但最好要 比理論計(jì)算時(shí)間更長(zhǎng)些，以彌補(bǔ)由于反應(yīng)系統(tǒng)粘度增大所產(chǎn)生的反 應(yīng)滯后作用。兩種酶的配比如下： 其中， Pfu和 DeepVent起著二次校對(duì)的作用。 內(nèi)標(biāo)使用相同的引物，與待測(cè)樣品具有相似的長(zhǎng)度、堿基組成以 及對(duì)抑制劑的敏感性，但又必須與待測(cè)樣品有所區(qū)別，以便在擴(kuò)增產(chǎn) 物檢測(cè)分析時(shí)能夠辨認(rèn)（如引物的檢測(cè)方式不同）。 PRINS是 FISH和 PCR的結(jié)合：首先使寡聚核苷酸引物與處于 M期的 染色體 DNA退火， 然后在熒光標(biāo)記的核苷酸和 Taq DNA聚合酶的存在下 進(jìn)行延伸反應(yīng)，合成一系列長(zhǎng)度在 2001000 bp之間 的 熒光探針，進(jìn)而 繪制細(xì)胞染色體的彩色圖譜。為數(shù)不 少的 PCR檢測(cè)程序已自動(dòng)化，包括樣品預(yù)處理、擴(kuò)增反應(yīng)、產(chǎn)物檢測(cè)。適用于繪制真 核生物龐大基因或基因 組中的缺失圖譜，如分 子病的臨床輔助診斷。 標(biāo)準(zhǔn)的 RTPCR程序包括： mRNA的分離 cDNA反應(yīng)的引物退火 mRNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA cDNA的 PCR擴(kuò)增 引物選擇有三種戰(zhàn)略： 基因特異性引物化（ GSP）， 最精確最靈敏 寡聚 dT引物化 隨機(jī)六聚體引物化 反向 PCR（ Inverted PCR） 通常 ， PCR反應(yīng)是對(duì)兩條引物之間 的序列進(jìn)行擴(kuò)增，但如果將模板 DNA稍 酶切 環(huán)化 酶切 擴(kuò)增 做處理，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)已知序列兩側(cè)的片 段進(jìn)行擴(kuò)增，這種戰(zhàn)略稱為 反向 PCR技 術(shù) 。達(dá)到這個(gè)階段所需要的循環(huán)次數(shù)可由下式計(jì)算： 影響上述擴(kuò)增閾值的主要因素包括： 擴(kuò)增底物（引物和 dNTPs） 有效濃度的下降 Nf = N0 X 2 N 其中 N為循環(huán)次數(shù)， N0為起始拷貝數(shù)， N0為最終拷貝數(shù) Nf = N0 （ 1 + Y） N 非特異性產(chǎn)物或引物二聚體對(duì)反應(yīng)試劑的競(jìng)爭(zhēng)作用 反應(yīng)試劑的穩(wěn)定性 擴(kuò)增產(chǎn)物抑制作用 高濃度產(chǎn)物的退活作用以及不完全變性 特異性的改進(jìn)： 降低循環(huán)次數(shù)，減小擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。 預(yù)熱變性溫度和時(shí)間 預(yù)熱溫度和時(shí)間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 92 96℃ 30 secs 10 mins 在酶不存在時(shí)，預(yù)熱能滅活樣品中有害的蛋白酶和核酸酶，同時(shí) 又能保證模板的完全變性，尤其是基因組 DNA直接作為模板使用