熒光定量pcrppt課件(完整版)
【正文】 以 RNA作 PCR陰性對(duì)照 CW0580 CW0592 CW0581 CW2090A RTqPCR一步法還是兩步法？ 兩步法： 步驟多但靈活多樣。 誤差控制 ? 使用 Master mix ? 配置預(yù)混體系 ? 設(shè)置生物學(xué)重復(fù) （不同個(gè)體） 技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔） ? 陰性對(duì)照 熒光定量 PCR體系 2ΔΔ Ct法 滿足條件： 1）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近 正負(fù) 10% 2）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率基本為 90%110% 相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析 目標(biāo)基因的 CT值 內(nèi)參基因的 CT值 待測(cè)樣本的 ΔCT 值 對(duì)照樣本的 ΔCT 值 計(jì)算表達(dá)水平比率： 2 –ΔΔCT =表達(dá)量的比值 2△△ Ct 法 目的 基因 內(nèi)參 基因 目的基因 內(nèi)參基因 △ Ct 待測(cè)樣本 對(duì)照樣本 △△ Ct 倍數(shù)值 fold 2△△ Ct 對(duì)照樣本 0 1 待測(cè)樣本 Trouble shooting 常見(jiàn)問(wèn)題 可能原因 解決方法 Housekeeping gene 無(wú)信號(hào) RNA降解 用新鮮組織提取 RNA Housekeeping gene 有信號(hào) 而目標(biāo)基因無(wú)信號(hào) 1. 目的基因表達(dá)低。 模板濃度進(jìn)行 10倍稀釋，稀釋 6個(gè)梯度。 4. 嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。每次只能做一個(gè)基因。 染料法與探針?lè)? 對(duì)比 探針?lè)? ? 特異性高 與探針與特異靶序列結(jié)合 ? 對(duì)模板有選擇性 可進(jìn)行多重 PCR反應(yīng) ? 成本高 不同靶基因需要合成不同探針 染料法 ? 通用性好 對(duì) DNA模板沒(méi)有選擇性 ? 使用方便，成本低 僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物 ? 有假陽(yáng)性現(xiàn)象 通過(guò)融解曲線判斷 Realtime PCR 應(yīng)用 ? 基因表達(dá)分析 相對(duì)定量： 基因表達(dá)量的差異 絕對(duì)定量： 樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克） ? 基因型分析 SNP檢測(cè) 等位基因檢測(cè) 甲基化檢測(cè) 基因表達(dá)分析檢測(cè) test sample 處理樣本 target gene 目的基因 reference gene 內(nèi)參基因 total RNA cDNA calibrator sample 對(duì)照樣本 target gene 目的基因 reference gene 內(nèi)參基因 qPCR 以各自樣本中內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)桿， 比較兩樣本中目的基因的相對(duì)豐度。 3’ AAAAAAAA 5’cap miRNA作用靶點(diǎn) 編碼區(qū) mRNA microRNA分子功能 microRNA 的來(lái)源 miRNA前體與成熟體 靶點(diǎn)識(shí)別 –不嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì) ? 一個(gè) miRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)基因 ? 一個(gè)基因可受多個(gè)miRN
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