熒光定量pcrppt課件(存儲版)
【正文】 個 miRNA ? 加尾法 ， 5個目標獲得良好檢測 ? 莖環(huán)法， 4個目標獲得良好檢測 ? 1個目標的檢測很難，嘗試多種引物設計，調整反應體系 康為 miRNA產品 小 RNA提取試劑盒 加尾法 miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒 miRNA熒光定量 PCR檢測試劑盒 CW0627 CW2141 CW2142 康為 miRNA檢測服務 全套 miRNA檢測：從生物樣本到數(shù)據(jù) 莖環(huán)法 miRNA檢測引物：定制 (Real time Quantitative PCR) ?miRNA的特點及檢測 ?熒光定量 PCR檢測 內 容 PCR： 偉大的天才發(fā)明 ? Use of LSD ? Synthesis and selftesting of novel psychoactive substances ? Belief in astrology PCR：理想與現(xiàn)實 起點定量 終點定量 ? 起點定量檢測 ： 起點量是樣本中未經 PCR放大 之前的模板量 具有重現(xiàn)性，誤差小 “加入了 500個拷貝 ” ? 終點定量檢測 ： 終點產物量經過 PCR放大的 DNA量 不恒定，誤差大 “生成了 500， 0000， 0000個拷貝 ” 擴增曲線 Ct值： ?模板 DNA量越多， 熒光強度達到檢測域值所需的循環(huán)數(shù) 越少， 即 Ct值越小。 不同環(huán)境，不同器官、組織、細胞類型之間，表達量相對恒定。 ? 需參照儀器要求選擇。 熒光定量產品 染料法 FastSYBR Mixture UltraSYBR Mixture ?GoldStar Taq ?特異性強 ?靈敏度高 ?Ct值更低 ?線性范圍更廣 ?定量更準確 ?反應速度快 ?比普通反應可節(jié)省約 40分鐘 ?適合于普通和快速定量 PCR程序 熒光定量產品 染料法 某其它品牌 康為 UltraSYBR cDNA用內參 actin引物進行擴增，產物片段 100bp。 Housekeeping gene 反應效率正常 ,但 目標基因放大效率不高 PCR引物不良 重新設計引物，減小產物大小，改換目標區(qū)段， 考慮不同剪接體 目標基因表達豐度在 樣本之間異常一致 RNA被基因組 DNA污染 intron 引物 DNase處理 RNA RNA陰性對照表現(xiàn)陰性 溶解曲線出現(xiàn)雜峰 PCR產物 PCR引物 ，升高復性溫度 ，將檢測溫度設定在在引物二聚體解鏈溫度與 PCR特異產物解鏈溫度之間。 推薦：工作的成熟階段，以及多個樣本單個靶基因檢測。 數(shù)據(jù)分析 qPCR cDNA total RNA 內參基因的選擇 特點 選擇內參基因 內參基因 betaactin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rR
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