熒光定量pcrppt課件-免費(fèi)閱讀
【正文】 陰性對(duì)照在 30個(gè)循環(huán) 以?xún)?nèi)出現(xiàn)信號(hào) 試劑被污染 PCR產(chǎn)物 查找，替換污染試劑 2. 使用 UNG系統(tǒng)。 逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄引物選擇 – 下游應(yīng)用：是否檢測(cè)其它基因？ – Abundant RNA的干擾： mRNA or total RNA？ – 檢測(cè)靈敏度是否足夠？ 逆轉(zhuǎn)錄酶 – SuperRT 逆轉(zhuǎn)錄酶（ RNase H） – HiFiMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（ RNase H） 引物 特異性 反應(yīng)效率 Oligo dT 中 低 Random hexmer 低 中 Specific primer 高 高 CW0741 CW0743 總原則與普通 PCR相同： ? 避免引物二聚體，避免二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（ 80 – 300 bp) ? 推薦做跨 intron設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)原則 EXON 1 EXON 2 INTRON 2 DNA EXON 1 EXON 2 RNA 反應(yīng)條件優(yōu)化 內(nèi)參基因 – 目的基因 融解曲線(xiàn)： 單一特異性產(chǎn)物 擴(kuò)增曲線(xiàn)： Ct值 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)： 擴(kuò)增效率盡量高，目的基因 盡可能接近內(nèi)參基因 反應(yīng)條件優(yōu)化 融解曲線(xiàn)分析 單一特異性產(chǎn)物 將溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo) 圖 2 Effciency slope 內(nèi)參基因 100% 目的基因 Primer 2 78% 圖 1 Effciency slope 內(nèi)參基因 100% 目的基因 Primer 1 % 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析 擴(kuò)增效率盡量高 目的基因盡可能接近內(nèi)參基因 10%以?xún)?nèi) 反應(yīng)條件優(yōu)化 反應(yīng)條件優(yōu)化 擴(kuò)增曲線(xiàn)分析 Ct值 第一對(duì)引物ct=21 .36第二對(duì)引物ct=25 .14第一對(duì)引物第二對(duì)引物 Master Mix的應(yīng)用 熱啟動(dòng)酶 ? 化學(xué)修飾， 常溫下完全沒(méi)有聚合酶活性，熱復(fù)活需 95℃ 10分鐘 GoldStar、 HotStar ? 非化學(xué)修飾 （ Oligo修飾、抗體修飾、 Mg2+螯合物） 熱復(fù)活僅需 95℃ 幾十秒 FastStar Buffer ? 反應(yīng)增強(qiáng)劑 減少引物二聚體，進(jìn)一步提高反應(yīng)特異性 對(duì)于復(fù)雜模板，提高反應(yīng)效率 ? 穩(wěn)定劑 dNTP Master Mix的應(yīng)用 ROX Passive Reference ? 不參與、不干擾 PCR反應(yīng) ? 恒定發(fā)射熒光信號(hào) ? 用于校正因信號(hào)檢測(cè)器到各孔間光路不同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。 對(duì)樣本初始濃度差異進(jìn)行均一化校正。一次逆轉(zhuǎn) 錄獲得的 cDNA可用于多個(gè) 目標(biāo)分子的檢測(cè)。 成熟 miRNA qPCR檢測(cè) – 莖環(huán)法 優(yōu)點(diǎn)：特異引物逆轉(zhuǎn)錄，理論上效率更高，檢測(cè)更靈敏 缺點(diǎn)：莖環(huán)引物設(shè)計(jì)復(fù)雜；特異引物逆轉(zhuǎn)錄不便多基因檢測(cè) 檢測(cè)方法選擇 ? 依樣本特性，檢測(cè)目標(biāo)多寡而定 ? 康為技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)舉例： – 復(fù)旦大學(xué)某客戶(hù) ? miRNA芯片提示 10個(gè) miRNA在病人與正常人之間有顯著差異表達(dá) ? 要求從 66個(gè)外周血 RNA樣本中檢測(cè)這 10
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