《熒光定量pcr》ppt課件-全文預覽
【正文】 ?定量更準確 ?反應速度快 ?比普通反應可節(jié)省約 40分鐘 ?適合于普通和快速定量 PCR程序 熒光定量產品 染料法 某其它品牌 康為 UltraSYBR cDNA用內參 actin引物進行擴增，產物片段 100bp。減小產物大小，改換目標 區(qū)段，考慮不同剪接體。 ? 需參照儀器要求選擇。 一步法： 簡單、靈敏度高，有效減少實驗操作誤差和污染。 不同環(huán)境，不同器官、組織、細胞類型之間，表達量相對恒定。 SYBR Green I 工作原理 Taqman 工作原理 在退火過程中，探針與靶序列結合 探針被 Taq酶的 5’ 3’ 外切酶活性剪切成片斷 游離報告基團發(fā)出熒光 在延伸過程中，探針部分與靶序列分離 熒光信號強度與結合探針的 DNA分子成正比。 成熟 miRNA qPCR檢測 – 莖環(huán)法 優(yōu)點：特異引物逆轉錄，理論上效率更高，檢測更靈敏 缺點：莖環(huán)引物設計復雜；特異引物逆轉錄不便多基因檢測 檢測方法選擇 ? 依樣本特性，檢測目標多寡而定 ? 康為技術服務經驗舉例： – 復旦大學某客戶 ? miRNA芯片提示 10個 miRNA在病人與正常人之間有顯著差異表達 ? 要求從 66個外周血 RNA樣本中檢測這 10個 miRNA ? 加尾法 ， 5個目標獲得良好檢測 ? 莖環(huán)法， 4個目標獲得良好檢測 ? 1個目標的檢測很難，嘗試多種引物設計，調整反應體系 康為 miRNA產品 小 RNA提取試劑盒 加尾法 miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒 miRNA熒光定量 PCR檢測試劑盒 CW0627 CW2141 CW2142 康為 miRNA檢測服務 全套 miRNA檢測：從生物樣本到數據 莖環(huán)法 miRNA檢測引物：定制 (Real time Quantitative PCR) ?miRNA的特點及檢測 ?熒光定量 PCR檢測 內 容 PCR： 偉大的天才發(fā)明 ? Use of LSD ? Synthesis and selftesting of novel psychoactive substances ? Belief in astrology PCR：理想與現實 起點定量 終點定量 ? 起點定量檢測 ： 起點量是樣本中未經 PCR放大 之前的模板量 具有重現性，誤差小 “加入了 500個拷貝 ” ? 終點定量檢測 ： 終點產物量經過 PCR放大的 DNA量 不恒定，誤差大 “生成了 500， 0000， 0000個拷貝 ” 擴增曲線 Ct值： ?模板 DNA量越多， 熒光強度達到檢測域值所需的循環(huán)數 越少， 即 Ct值越小。北京康為世紀生物科技有限公司 實時熒光定量 PCR Real Time Quantitative PCR 內 容 ?miRNA的特點及檢測 ?熒光定量 PC
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