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《研究生pcr》ppt課件-全文預(yù)覽

2025-06-02 03:08 上一頁面

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【正文】 產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好 — 引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會 實例:設(shè)計人類 GAPDH基因 mRNA的引物 1. 用 Primer Premier軟件設(shè)計引物; 2. 在 UCSC Genome Browser上驗證(如果失敗則重新設(shè)計) 1. 我們設(shè)計的引物,是根據(jù) GAPDH的 mRNA序列設(shè)計的,理論擴增長度是 318bp,但它卻在人類基因組上擴增出了 兩個片段 ; 2. 第一個片段來自 12號染色體 的擴增,長度為2409bp;第二個片段來自 X染色體 的擴增,片段長度是 318bp。 ?實際擴增率: (1+X )n, X為 PCR的實際擴增率 , 平均約為 75%。 待擴增片段 高溫變性 低溫退火 中溫延伸 ?PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過 溫度的改變 控制 。 1988年 Saiki開始將 耐熱性 Taq DNA聚合酶應(yīng)用于 PCR, 整個反應(yīng)只加一次酶即可 , 擴增特異性和效率都明顯改善 , 操作大為簡化 。 發(fā)展歷程 1971年 , Khorana( 美國 MIT教授 , 1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主 ) : “ 經(jīng)過 DNA變性 , 與合適引物雜交 , 用 DNA聚合酶延伸引物 , 并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 。 ?迅速獲取大量的單一核酸片段 , 為分子生 物學(xué)研究提供了強大的工具 。 ?能通過試管內(nèi)的數(shù)小時反應(yīng)將特定的 DNA 片段擴增數(shù)百萬倍 。 70年代以來 , 人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無性繁殖體系 , 一是 基因克隆 技術(shù) , 二是 體外擴增 技術(shù) 。 1985年 , 美國 Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng) ( Polymerase Chain Reaction, PCR) , Saiki等首次應(yīng)用 PCR法成功地擴增了人 ?珠蛋白的 DNA, 并應(yīng)用于鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷 。 PCR的基本原理 試管中進(jìn)行的 DNA復(fù)制反應(yīng) , 依據(jù) ① DNA半保留復(fù)制 的機理; ② 體外 DNA分子于不同溫度下可 變性和復(fù)性的性質(zhì); 通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度 , 使 ① 雙鏈 DNA變成單鏈 , ② 單鏈 DNA與人工合成的 引物退火 , ③ DNA聚合酶使 引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈 DNA。 ?理論擴增率: 2n遞增 ( n為循環(huán)次數(shù) ) ,25~ 30循環(huán) , 目標(biāo) DNA可增加 109倍 。 PCR擴增曲線 PCR 反應(yīng)體系與流程 反應(yīng)體系 模板 ( DNA或 RNA) 引物 Taq DNA聚合酶 10 PCR緩沖液 ~ 4 mM Mg2+ mM dNTP 反應(yīng)流程 預(yù)變性 變性 退火 延伸 延伸完全 終止 25~ 35循環(huán) 一、 PCR 的反應(yīng)體系 1. 引物( primer) 2. 酶 ( Taq DNA polymerase) 3. dNTP 4. 模板 ( template) 5. Mg2+ ( magnesium) 引物 引物:決定 PCR反應(yīng)的特異性 PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度 理論上,只要知道任何一段模板 DNA序列,就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,用 PCR就可將模板
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