《研究生pcr》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好 — 引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì) 實(shí)例：設(shè)計(jì)人類 GAPDH基因 mRNA的引物 1. 用 Primer Premier軟件設(shè)計(jì)引物； 2. 在 UCSC Genome Browser上驗(yàn)證（如果失敗則重新設(shè)計(jì)） 1. 我們?cè)O(shè)計(jì)的引物，是根據(jù) GAPDH的 mRNA序列設(shè)計(jì)的，理論擴(kuò)增長(zhǎng)度是 318bp，但它卻在人類基因組上擴(kuò)增出了 兩個(gè)片段 ； 2. 第一個(gè)片段來(lái)自 12號(hào)染色體 的擴(kuò)增，長(zhǎng)度為2409bp；第二個(gè)片段來(lái)自 X染色體 的擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度是 318bp。 ?實(shí)際擴(kuò)增率： (１＋Ｘ )n， X為 PCR的實(shí)際擴(kuò)增率 ， 平均約為 75%。 待擴(kuò)增片段 高溫變性 低溫退火 中溫延伸 ?PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過(guò) 溫度的改變 控制 。 1988年 Saiki開(kāi)始將 耐熱性 Taq DNA聚合酶應(yīng)用于 PCR， 整個(gè)反應(yīng)只加一次酶即可 ， 擴(kuò)增特異性和效率都明顯改善 ， 操作大為簡(jiǎn)化 。 發(fā)展歷程 1971年 ， Khorana（ 美國(guó) MIT教授 ， 1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主 ） ： “ 經(jīng)過(guò) DNA變性 ， 與合適引物雜交 ， 用 DNA聚合酶延伸引物 ， 并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆 tRNA基因 。 ?迅速獲取大量的單一核酸片段 ， 為分子生 物學(xué)研究提供了強(qiáng)大的工具 。 ?能通過(guò)試管內(nèi)的數(shù)小時(shí)反應(yīng)將特定的 DNA 片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍 。 70年代以來(lái) ， 人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無(wú)性繁殖體系 ， 一是 基因克隆 技術(shù) ， 二是 體外擴(kuò)增 技術(shù) 。 1985年 ， 美國(guó) Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng) （ Polymerase Chain Reaction， PCR） ， Saiki等首次應(yīng)用 PCR法成功地?cái)U(kuò)增了人 ?珠蛋白的 DNA， 并應(yīng)用于鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷 。 PCR的基本原理 試管中進(jìn)行的 DNA復(fù)制反應(yīng) ， 依據(jù) ① DNA半保留復(fù)制 的機(jī)理； ② 體外 DNA分子于不同溫度下可 變性和復(fù)性的性質(zhì)； 通過(guò)人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度 ， 使 ① 雙鏈 DNA變成單鏈 ， ② 單鏈 DNA與人工合成的 引物退火 ， ③ DNA聚合酶使 引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈 DNA。 ?理論擴(kuò)增率： 2n遞增 （ n為循環(huán)次數(shù) ） ，25～ 30循環(huán) ， 目標(biāo) DNA可增加 109倍 。 PCR擴(kuò)增曲線 PCR 反應(yīng)體系與流程 反應(yīng)體系 模板 （ DNA或 RNA） 引物 Taq DNA聚合酶 10 PCR緩沖液 ～ 4 mM Mg2+ mM dNTP 反應(yīng)流程 預(yù)變性 變性 退火 延伸 延伸完全 終止 25～ 35循環(huán) 一、 PCR 的反應(yīng)體系 1. 引物（ primer） 2. 酶 （ Taq DNA polymerase） 3. dNTP 4. 模板 （ template） 5. Mg2+ （ magnesium） 引物 引物：決定 PCR反應(yīng)的特異性 PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度 理論上，只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板
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