《綠色熒光蛋白》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 類基因組中常用的密碼子代替，將 GFP的熒光強(qiáng)度提高 22倍，適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)。目前，對(duì)于 GFP的作用機(jī)理較為認(rèn)同的僅僅是： GFP是生物發(fā)光過(guò)程中的能量受體，并且是最終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異。 綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán) Stereo view of the fluorophore and its environment. His148, Gln94 and Arg96 can be seen on opposite ends of the fluorophore and probably stabilize resonant forms of the fluorophore. Charged, polar, and nonpolar side chains all contact the fluorophore in some way. 綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán) His48 Gln94 Arg96 Model of the fluorophore and its environment superposed on the MADphased electron density map at 197。發(fā)色團(tuán)（右圖）由蛋白質(zhì)鏈上的三個(gè)氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和蘇氨酸（或絲氨酸）自發(fā)形成。蛋白質(zhì)鏈形成一個(gè)圓柱形罐頭（藍(lán)色），子鏈的一部分直接從中間穿過(guò)（綠色），發(fā)色團(tuán)剛好在罐頭盒的中間，它被保護(hù)起來(lái)以免受周圍環(huán)境的影響。中度氧化劑對(duì) GFP熒光影響也不大，如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。 ? 盡管 450～ 490nm(藍(lán)光 )是 GFP的副吸收峰，但由于長(zhǎng)波能量低，細(xì)胞忍受能力強(qiáng) ,因此更適合于活體檢測(cè)。 綠色熒光蛋白的研究史 綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析 綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析 維多利亞水母 GFP的 cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng) 717nt 綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析 維多利亞水母 GFP由 238 aa組成，分子量約 27 kD 綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析 GFP 晶體結(jié)構(gòu)顯示 , 蛋白質(zhì)中央是一個(gè)罐形結(jié)構(gòu) , 長(zhǎng) 420 nm , 寬 240 nm , 由 11 個(gè)圍繞中心 α螺旋的反平行β折疊組成 , 熒光基團(tuán)的形成就是從這個(gè)螺旋開(kāi)始的 , 罐的頂部由 3 個(gè)短的垂直片段覆蓋 , 底部由一個(gè)短的垂直片段覆蓋 , 對(duì)熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔內(nèi)。 1997年 10月 1822日在美國(guó) NewJersey專門召開(kāi)了一次關(guān)于GFP的國(guó)際會(huì)議。 錢永健 ? 錢永健在改造 GFP方面取得了卓越的成就。 沙爾菲 ? 如果說(shuō)下村修是綠色熒光蛋白的“接生婆”，沙爾菲則是綠色熒光蛋白的價(jià)值發(fā)現(xiàn)者。 ? 這種捕獲藍(lán)光、發(fā)出綠光的蛋白質(zhì)，就是GFP ? 水母發(fā)光蛋白發(fā)出的藍(lán)光通過(guò)能量轉(zhuǎn)移激發(fā) GFP發(fā)出綠光 1. 水母發(fā)光蛋白 脫輔水母發(fā)光蛋白 +氧化熒光素 +藍(lán)光 ? 綠色熒光蛋白 綠光 ? 水母素在鈣離子的刺激下發(fā)光，其能量可轉(zhuǎn)移到GFP上，刺激 GFP發(fā)光。 馬丁 Howard Hughes Medical Institute 2022年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者及其貢獻(xiàn) 下村修，日本人，名古屋大學(xué)理學(xué)博士畢業(yè)后赴美，先后在美國(guó)普林斯頓大學(xué)、波士頓大學(xué)和伍茲霍爾海洋生物實(shí)驗(yàn)所工作。 Boston University Medical School Massachusetts, MA, USA Columbia University New York, NY, USA University of California San Diego, CA, USA。其主要貢獻(xiàn)在于利用水母發(fā)出綠光的化學(xué)物來(lái)追查實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行的生物反應(yīng)，他被認(rèn)為是這方面公認(rèn)的先驅(qū)。 綠色熒光蛋白的研究史 維多利亞水母 (Aequorea Victoria) A test tube containing a sample of a cyan (greenishblue) fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultraviolet light from below. ? 水母體內(nèi)有一種發(fā)光蛋白 ——Aequorin，它與鈣離子結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出藍(lán)光，這道藍(lán)光立刻被一種蛋白吸收，從而發(fā)出綠色螢光。 綠色熒光蛋白的研究史 馬丁 綠色熒光蛋白的研究史 ? 1994年 Chalfie等首次在大腸桿菌細(xì)胞和線蟲中表達(dá)了GFP，開(kāi)創(chuàng)了 GFP應(yīng)用研究的先河。 ? 之后很快發(fā)現(xiàn) GFP能在多種異源細(xì)胞中表達(dá)， GFP在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域中迅速掀起了一股熱潮。這是繼美國(guó)、韓國(guó)、日本之后第四例成功通過(guò)體細(xì)胞核移植方式生出的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬。 綠色熒光蛋白的發(fā)光特性 ? GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽 (FITC)很相似，因此為熒光素 FITC設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡濾光片組合也適用 GFP觀察。而一些弱還原劑并不影響 GFP熒光。
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