【正文】 傳代細(xì)胞系一般是由人或動(dòng)物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來(lái)，可懸浮培養(yǎng)或采用載體培養(yǎng)，能大規(guī)模生產(chǎn)。 （四）生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng) 生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境應(yīng)符合本規(guī)程‘細(xì)胞庫(kù)的建立’中有關(guān)規(guī)定?！? 下述兩種致癌性試驗(yàn)方法可任選其一： ①裸鼠 至少 10 只，將細(xì)胞懸浮于適量無(wú)血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度為 5107個(gè) 細(xì)胞 /ml，每只裸鼠皮下或肌內(nèi)注射 ；同時(shí)用 Hela 或 Hep2 細(xì)胞設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照組至少 10 只，每只注射 含 106個(gè)細(xì)胞；可用人二倍體細(xì)胞株作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照組至少 10 只，每只注射 含 1067個(gè)細(xì)胞。在某些情況下，也可能進(jìn)行轉(zhuǎn)化病毒的檢測(cè)，如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)，建議進(jìn)行透射電鏡檢查及感染性試驗(yàn)，以確證是否有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒存在。家兔主要用于檢測(cè)猴來(lái)源細(xì)胞中是否存在 B 病毒污染，也可用兔腎細(xì)胞培養(yǎng)法代替。 （ 3）接種動(dòng)物和雞胚法檢測(cè)病毒因子 MCB 或 WCB 細(xì)胞、增殖到或超過(guò)生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞須采用動(dòng)物體內(nèi)接種法進(jìn)行外源病毒因子檢測(cè)。每種單層細(xì)胞接種至少 107個(gè)含有原細(xì)胞培養(yǎng)上清液的活細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解物，每種細(xì)胞至少接種 2 瓶。細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類(lèi)及方法，須根據(jù)細(xì)胞的種屬來(lái)源、組織來(lái)源及細(xì)胞特性決定。 表 細(xì)胞檢定項(xiàng)目要求 *生產(chǎn)終末細(xì)胞 :是指按生產(chǎn)規(guī)模制備的終末代次細(xì)胞。 主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)分別存放。每個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的工作細(xì)胞庫(kù)必須限定為一個(gè)細(xì)胞 代次。在某些特殊情況下，也可使用 MCB 一級(jí)庫(kù)，但須得到國(guó)務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門(mén)的批準(zhǔn)。特別應(yīng)檢測(cè)胰蛋白酶來(lái)源的動(dòng)物可能攜帶的病毒，如細(xì)小病毒等。 2．細(xì)胞系 /株培養(yǎng)歷史的資料 應(yīng)具有細(xì)胞分離方法、細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程及建立細(xì)胞系 /株過(guò)程的相關(guān)資料，包括所使用的物理、化學(xué)或生物學(xué)手段，是否有外源添加序列，以及細(xì)胞生長(zhǎng)特征、生長(zhǎng)液成分、選擇細(xì)胞所進(jìn)行的任何遺傳操作或選擇方法等。生產(chǎn)重組制品的細(xì)胞基質(zhì)，系指含所需序列的、從單個(gè)前體細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)，系指通過(guò)親本骨髓瘤細(xì)胞系與另一親本細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞系。同時(shí)還應(yīng)具有細(xì)胞鑒別、檢定、內(nèi)源及外源因子檢查 結(jié)果的相關(guān)資料。 用于生物制品生產(chǎn)的培養(yǎng)物中不得使用青霉素或β 內(nèi)酰胺 (β Lactam)類(lèi)抗生素。 （ 1）原始細(xì)胞庫(kù) (PCB) 由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體，或經(jīng)過(guò)克隆培養(yǎng)而形成的均一細(xì)胞群體，通過(guò)檢定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢定。凍存時(shí)細(xì)胞的傳代水平須確保細(xì)胞復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞數(shù)量能滿(mǎn)足生產(chǎn)一批或一個(gè)亞批制品。非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開(kāi)存放。 1．細(xì)胞鑒別試驗(yàn) 新建細(xì)胞系 /株、細(xì)胞庫(kù) (MCB 和 WCB)和生產(chǎn)終末細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，以確認(rèn)為本細(xì)胞，無(wú)其他細(xì)胞的交叉污染。 （ 1）細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察及血吸附試驗(yàn) 取混合瓶細(xì)胞樣品，接種至少 6 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后換維持液，持續(xù)培養(yǎng)兩周。接種供試品量應(yīng)占維持液的 1/4 以上，培養(yǎng)至少 14 天。選用乳鼠、成鼠和雞胚 (兩組不同日齡 )共計(jì) 4 組， 按表 2 所列方法進(jìn)行試驗(yàn)和觀(guān)察。 （ 4）逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測(cè) 可采用下列方法對(duì) MCB 或 WCB 細(xì)胞、增殖到或超過(guò)生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)。 小鼠來(lái)源和其他嚙齒類(lèi)來(lái)源的細(xì)胞系或其雜交瘤細(xì)胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些病毒的檢測(cè)可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測(cè)技術(shù)。 ②新生小鼠 (3~5 日齡 )， 8~10g 小鼠 10 只，在出生后第 0 天、 2 天、 7 天和第 14 天，分別用 抗胸腺血清 (ATS)或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種107活細(xì)胞。 從凍存的 WCB 中取出一支或多支安瓿，混合后培養(yǎng)，傳至一定代次后供生產(chǎn)用。這些細(xì)胞可無(wú)限傳代，但到一定代次后，致瘤性會(huì)增強(qiáng)。 人二倍體細(xì)胞株應(yīng)在傳代過(guò)程的早期，選擇適當(dāng)世代水平（ 28 世代）增殖出大量細(xì)胞，定量分裝后，置液氮中或 – 130℃下凍存，供建立 PCB 之用，待全部檢定合格后，即可正式定為 PCB，供制備 MCB 用。染色體片應(yīng)長(zhǎng)期保存，以備復(fù)查。 5 致瘤性檢查 每 8~12 世 代應(yīng)作一次致瘤性檢查，（方法見(jiàn)本規(guī)程 ‘致瘤性檢查’），結(jié)果應(yīng)無(wú)致癌性。 （ 5） 正常細(xì)胞外源病毒因子檢測(cè) 制備病毒類(lèi)制品時(shí)，于接種病毒的當(dāng)天或在連續(xù)傳代的最后一次接種病毒時(shí)，留取此批細(xì)胞的 5%(或不少于 500ml)的細(xì)胞不接種病毒，換維持液作為正常細(xì)胞對(duì)照。 （一）動(dòng)物組織來(lái)源和 其他材料 1．動(dòng)物組織來(lái)源 應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。 1．細(xì)胞培養(yǎng) 原材料檢查及細(xì)胞培養(yǎng)操作按本規(guī)程 “ 原材料的選擇”及“細(xì)胞培養(yǎng)操作的環(huán)境要求”進(jìn)行。地鼠腎原代細(xì)胞應(yīng)用 BHK21 細(xì)胞培養(yǎng)檢查，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，如有可疑應(yīng)在同種細(xì)胞上盲傳一代繼續(xù)觀(guān)察。 （二）細(xì)胞檢定 生物制品檢定用細(xì)胞應(yīng)至少進(jìn)行以下 13 項(xiàng)檢定， 根據(jù)檢定用細(xì)胞用途的不同， 還應(yīng)按照 4 項(xiàng)下的有關(guān)要求進(jìn)行相關(guān)的檢定。 附錄 逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢查法 附錄 IX M 逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢查法 本法系以雀麥草花葉病毒 RNA 為模板，采用 RTPCR 法擴(kuò)增特定片段并用ELISA 法檢測(cè)特異片段與探針的雜交信號(hào)，從而測(cè)定供試品中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 (2)陽(yáng)性對(duì)照 用 SP2/0 細(xì)胞培養(yǎng)上清液作陽(yáng)性對(duì)照，同上處理后，按單次使用量分裝， 70℃ 保存?zhèn)溆??；靹蚝?，按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增： 37℃30 分鐘， 預(yù)變性 94℃5 分鐘， 94℃45秒， 56℃45 秒， 72℃45 秒，進(jìn) 行 35 個(gè)循環(huán)， 72℃ 延伸 5 分鐘。 注意事項(xiàng) （ 1）如供試品為培養(yǎng)細(xì)胞，則將細(xì)胞傳代后，培養(yǎng) 34 天長(zhǎng)成單層，取上清檢測(cè)，取供試品前不得換液。與 RNA 操作有關(guān)的試劑及材料均需經(jīng)過(guò) DEPC 處理。以 630nm為參 考波長(zhǎng)，于波長(zhǎng) 492nm 處測(cè)定吸光度。 檢查法 （ 1） 反轉(zhuǎn)錄 將已處理的供試品及 陽(yáng)性對(duì)照用 A 液作 10 倍稀釋。 (2)供試品保存液 (Ｂ液 ) 每 1L A 液中含 1mg 亮抑蛋白酶肽、 抑胃肽及