【正文】 料，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接監(jiān)測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。 64. 信息分子：攜帶生物信號(hào)，在細(xì)胞之間進(jìn)行傳遞的小分子化學(xué)物質(zhì)。 68. 粘粒（cosmid）：是由大部分質(zhì)粒序列包括復(fù)制原點(diǎn)、抗性標(biāo)記等和噬菌體的cos粘端序列構(gòu)建而成，可攜帶較長(zhǎng)的DNA插入片段（40～50kb）。 1）真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)； 2）由染色體DNA和線粒體DNA組成； 3）非編碼序列多于編碼序列，編碼序列僅占3％左右； 4）存在大量重復(fù)序列； 5）結(jié)構(gòu)基因多為斷裂基因，有內(nèi)含子和外顯子組成； 6）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋樱?7）存在多基因家族和假基因； 8）體細(xì)胞為雙倍體，而精子和卵子為單倍體。 ：是DNA損傷較多時(shí)采取的修復(fù)方式，是先進(jìn)行復(fù)制再進(jìn)行切除修復(fù)。 4）移碼突變：基因堿基序列中發(fā)生單個(gè)核苷酸、數(shù)個(gè)核苷酸的缺失或插入，或核苷酸片段的缺失或插入，導(dǎo)致突變區(qū)域后的閱讀框移位。I基因是調(diào)節(jié)基因，可編碼產(chǎn)生阻遏蛋白，在沒(méi)有乳糖的條件下與操縱元件結(jié)合，操縱元件與啟動(dòng)子有部分重疊，從而抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 trp操縱子的另一個(gè)調(diào)控方式是衰減機(jī)制調(diào)節(jié)。與DNA結(jié)合的模體主要有： ：該結(jié)構(gòu)域中含有較多的半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）的區(qū)域，借肽鏈的彎曲使2個(gè)Cys 和2個(gè)His或4個(gè)Cys與一個(gè)鋅離子絡(luò)合成的指狀結(jié)構(gòu)。 九、真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制 真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要通過(guò)反式作用因子、順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用完成的，主要是反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響起始復(fù)合物形成的過(guò)程。 4）反式作用因子的組合式調(diào)控使調(diào)控更精確。分布廣泛，主要參與細(xì)胞物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控；3）單次跨膜受體：全為糖蛋白，主要有酪氨酸蛋白激酶受體（胰島素受體、表皮生長(zhǎng)因子受體等）和非酪氨酸蛋白激酶受體（白介素受體、干擾素受體、生長(zhǎng)素受體等）。 2）存在激活性配體如腎上腺素時(shí)，受體與之結(jié)合，受體構(gòu)象改變，暴露出與G蛋白結(jié)合的部位，G蛋白與配體受體復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致G蛋白與GDP結(jié)合力下降，釋放GDP。 （一）IR介導(dǎo)的IRS1－Ras－MAPK信號(hào)通路1) 配體與受體的結(jié)合導(dǎo)致受體變?yōu)槎垠w結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致其發(fā)生自身磷酸化，并磷酸化IRS1(胰島素受體底物1)蛋白； 2）IRS1可結(jié)合Grb2蛋白（接頭蛋白，含1個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和2個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域），進(jìn)而結(jié)合并 13 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 活化調(diào)控分子SOS（小分子單體G蛋白調(diào)節(jié)因子GEF的一種）； 3）SOS促使Ras釋放GDP并結(jié)合GTP，使Ras激活，然后激活的Ras脫離SOS蛋白。 1）G1晚期的限制點(diǎn)：主要監(jiān)控細(xì)胞大小及環(huán)境中是否有生長(zhǎng)因子，細(xì)胞生長(zhǎng)到足夠大，并且成功完成DNA復(fù)制準(zhǔn)備工作，才可通過(guò)限制點(diǎn)。 3）G2M 轉(zhuǎn)折和M期的調(diào)控：G2M 轉(zhuǎn)折關(guān)卡主要監(jiān)控DNA是否受損及DNA是否已經(jīng)正確完全地復(fù)制。RB家族已發(fā)現(xiàn)的3個(gè)成員，RB、P10P130分子中都有個(gè)口袋結(jié)構(gòu)能與E2FDP1結(jié)合抑制它的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)p53還可以促進(jìn)BAX、EGFBP3(胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3)、FAS等基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)已通過(guò)G1S關(guān)卡的受損細(xì)胞發(fā)生凋亡。 3）兩條途徑串話：caspase8不僅能活化下游caspase，還能切割促凋亡因子Bid，使其活化并結(jié)合到線粒體，促進(jìn)Bax或Bak的活化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，活化內(nèi)源凋亡途徑。 2）來(lái)自真核細(xì)胞的目的基因要適當(dāng)改造。 ：1）只能整合到分裂相的細(xì)胞；2）容量?。ú怀^(guò)10kb）；3）病毒滴度不高；4）隨機(jī)整合，有激活癌基因的潛在危險(xiǎn)。 二十四、基因功能分析的三大策略 特定基因功能研究的基本策略：通過(guò)特定基因的導(dǎo)入和特定基因的剔除或表達(dá)的抑制，制備模式生物體或體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型，觀察和檢測(cè)其表型（包括整體、細(xì)胞、分子水平）的變化，從而分析、鑒定特定基因的功能。①可用于觀察特定基因在整體上的功能是否唯一，或可被其他基因替代；②一些胚胎發(fā)育期的重要基因多采用條件性基因敲除模型進(jìn)行研究；③可用于推斷基因在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用 3. 基因表達(dá)的抑制或沉默 基因表達(dá)的抑制或沉默是通過(guò)在RNA水平的干涉來(lái)分析特定基因功能的方法。 二十九、基因治療的策略 ：特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過(guò)定位重組，讓導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變。 三十三、哪些疾病可用基因治療 1）在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制； 2）必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳； 3）該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控； 4）該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮其生理作用； 5）該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果。過(guò)短影響PCR的特異性，過(guò)長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度，使延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃），影響產(chǎn)物的生成。一個(gè)典型的 PCR反應(yīng)約需酶量1 ，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。退火時(shí)間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 24 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 三十六、Westen blot法原理 首先將混合的的蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳按大小分開(kāi)，再通過(guò)電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或其他膜上。 ：常用的隨機(jī)引物是六核苷酸片段混合物，這些分子在每個(gè)位置上都有可能有含有所有4種堿基的組合，因此可以與任意核苷酸序列互補(bǔ)，作為DNA擴(kuò)增的引物。 優(yōu)點(diǎn)：無(wú)內(nèi)含子和重復(fù)序列。 ：采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可得到RNA或反義RNA探針。2）對(duì)反義RNA進(jìn)行些修飾，如用硫代磷酸核苷替代通常的核苷酸可以提高抗降解的能力；3）設(shè)計(jì)可調(diào)控表達(dá)反義RNA片段的質(zhì)粒。可用于篩選重組克隆和非重組克隆，稱為籃白篩選。 。 ：反義RNA抗RNase的能力不強(qiáng)，注射到體內(nèi)容易被降 26 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 解，殘余的少量反義RNA分布全身，無(wú)法得到很好的調(diào)節(jié)效果。缺點(diǎn)：探針可能存在高度重復(fù)序列，引起假陽(yáng)性。 ：在反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA反應(yīng)中，加入標(biāo)記核苷酸合成cDNA探針，可選用特異的寡核苷酸引物、隨機(jī)引物或oligo dT引物。 三十八、核酸分子雜交的影響因素 ：濃度高，復(fù)性快，長(zhǎng)度50～300堿基為宜； ：過(guò)高不利復(fù)性，過(guò)低局部雙鏈不易解離，適宜溫度為Tm25℃左右； ：雜交率隨離子強(qiáng)度增加而增加，不完全同源核酸分子雜交時(shí)可以選擇高鹽，高度同源核酸序列雜交可以在高溫、低鹽條件下進(jìn)行。在DNA聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒(méi)有3’羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。降低濃度可導(dǎo)致反應(yīng)速度減慢，可提高反應(yīng)的特異性，但過(guò)低會(huì)影響PCR產(chǎn)量。 ⑥引物5′端可修飾,引物5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，但對(duì)擴(kuò)增特 異性影響不大； 23 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 引物5′端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個(gè)堿基而對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)影響。 三十四、PCR原理及影響因素 原理：PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)的DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以相互轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱的DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。 －－改變細(xì)胞功能：如基因修飾腫瘤細(xì)胞的“疫苗”療法、基因修飾TIL的過(guò)繼免疫方法、免疫增強(qiáng)基因療法、原位修飾腫瘤免疫原性的基因療法。 ：1）顯微注射法；2）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染；3）精子載體法 二十六、基因診斷常用的技術(shù) (PCR) （RFLP） (SSCP) 二十七、基因診斷的特點(diǎn) ：因?yàn)榛蛲蛔兒屯庠粗虏』虼嬖谑羌膊∽钤急举|(zhì)的因素，所有基因診斷的特異性可高達(dá)100％； ：檢測(cè)靈敏度達(dá)pg水平，樣品使用量少； ，穩(wěn)定性好：任一有核細(xì)胞均可作為檢測(cè)樣本，如：血液、精子、唾液、尿液、毛發(fā)、牙齒等。 1. 轉(zhuǎn)基因模型的應(yīng)用 1）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分析特定基因功能：①確定特定基因的功能；②發(fā)現(xiàn)新的基因功能或未知基因的功能；③發(fā)現(xiàn)新基因（突變）；④研究基因表達(dá)的時(shí)空性；⑤建立外源基因表達(dá)、調(diào)控的動(dòng)物模型；⑥產(chǎn)生需要的器官或組織；⑦用于只在胚胎期表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)和功能的研究。 ：1）只能包裝小于5kb的目的基因片段，相對(duì)轉(zhuǎn)基因能力受限；2）整合時(shí)需要輔助病毒感染才能進(jìn)行復(fù)制，增加包裝的難度；3）很難大量生產(chǎn)；4）感染效率較逆轉(zhuǎn)錄病毒低；5）40％～80％成人人感染過(guò)該病毒，可能會(huì)引起免疫排斥。表達(dá)融合蛋白時(shí)可將目的基因連接于原核基因編碼序列。4)Sanger 測(cè)序 ：具有5’→3’聚合酶活性、3’→5’外切酶活性缺失5’→3’外切酶活性。 以Fas為例：Fas結(jié)合Fas L→Fas形成三聚體，激活死亡結(jié)構(gòu)域（DD）→募集接頭蛋白FADD（也含有DD）→FasFasLFADD形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），F(xiàn)ADD的死亡效應(yīng)域（DED）被激活→通過(guò)DED 募集caspase 8前體→caspase 8自我激活→激活caspase 3→細(xì)胞凋亡 (內(nèi)源性）：通常在生長(zhǎng)因子缺乏、生長(zhǎng)環(huán)境不適、化學(xué)物質(zhì)或射線導(dǎo)致DNA損傷后發(fā)生，細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿是關(guān)鍵步驟，需要調(diào)節(jié)蛋白Bcl2家族參與。RB基因表達(dá)異?？墒?duì)細(xì)胞增殖的控制，誘發(fā)腫瘤。 4）MG1有絲分裂關(guān)卡：該關(guān)卡主要監(jiān)控姐妹染色體是否穩(wěn)定地附著在紡錘體上。G1S轉(zhuǎn)折關(guān)卡主要監(jiān)控DNA是否受損。 十五、IPDAG在信號(hào)傳導(dǎo)中的作用（磷脂酰肌醇途徑） 1）信號(hào)分子與受體結(jié)合，引起受體構(gòu)象變化； 2）受體活化G蛋白（結(jié)合GTP，α亞基與βγ亞基解離）； 3）活化的G蛋白激活磷脂酶（PLC）； 4）PLC水解PIP2生成IP3 和DAG； 5）IP3 使鈣通道打開(kāi)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高； 6）Ca2+與DAG共同激活PKC； 7）Ca2+與CaM結(jié)合，激活多種蛋白激酶和蛋白磷酸酶。 6）cAMP作為第二信使激活PKA，后者進(jìn)而激活其他靶酶或直接間接激活反式作用因子（CREB），調(diào)節(jié)基因表達(dá)。 G蛋白激活后，離開(kāi)受體并解離成βγ亞基和α亞基GTP復(fù)合物，α亞基通過(guò)調(diào)節(jié)AC、PLCβ等活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP等第二信使的濃度，從而把信號(hào)傳導(dǎo)給下游分子。 十一、受體的功能、特點(diǎn)和類型 ：特異性結(jié)合外源信號(hào)分子，并將信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而產(chǎn)生生物效應(yīng)。 ：1）一般具三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域、結(jié)合其他蛋白的結(jié)合域；2）能識(shí)別并結(jié)合順式作用元件；3）對(duì)基因表達(dá)有正性和負(fù)性調(diào)控作用。 （HLH）：這種結(jié)構(gòu)能形成兩端具有兼性的α螺旋，螺旋間由不同長(zhǎng)度的環(huán)連接。L編碼的14個(gè)氨基酸短肽序列中有兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，位于片段1內(nèi)。當(dāng)環(huán)境中由以葡萄糖為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫橹饕荚磿r(shí)，cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使CAP發(fā)生變構(gòu)，從而可以與CAP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，激活RNA聚合酶活性，啟動(dòng)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，加速合成分解乳糖的3種酶。 五、原核、真核基因表達(dá)特點(diǎn) ：1）操縱子模型普遍性；2）阻遏蛋白與阻遏機(jī)制普遍性；3）σ因子決定RNA聚合酶識(shí)別特異性；4）轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程耦聯(lián)，產(chǎn)物為多順?lè)醋樱?）僅一種RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄所有基因；6） tRNA和rRNA前體需要加工修飾，m