組化3第三章酶組化-文庫吧在線文庫
【正文】 說明： 鈣鈷法在一般實(shí)驗(yàn)室仍是常用的方法，但因其化學(xué)反應(yīng)多次轉(zhuǎn)換，容易造成定位不準(zhǔn)確；石蠟切片雖然也能顯示 ALP活性，但經(jīng)石蠟包埋處理（包括酒精、二甲苯、高溫等），酶活性喪失大部分。 （三）光鏡顯示 ACP有鉛法和偶氮偶聯(lián)法： 鉛法： 1）孵育液的配制： , 10ml 蔗糖 g 硝酸鉛 Pb(NO3)2 10mg 3%(約 )β甘油磷酸鈉 1 ml 按上述順序加入 ,待硝酸鉛完全溶解后再逐滴 加入底物 ,邊加邊攪至溶液完全透明。 （二）反應(yīng)原理 ? 底物經(jīng)酶水解，用金屬離子捕捉生成的磷酸離子而形成沉淀。 ⑦ 甘油明膠封固。 （ 1）方法與步驟： ① 新鮮組織 ,冰凍切片 , ② 3%冷福爾馬林固定 5分鐘 。 ATPase水解磷酸之間的高能鍵，釋放大量的能量，而不是水解磷酸與碳之間的鍵。 ⑤ 流水洗； ⑥甘油明膠封固。 (5)對照 : 同鉛法，可除去底物或用 223。 （ 2）孵育液的配制： 5％吐溫 60（或 80）水溶液 2ml Tris緩沖液（ ~） 5ml 10%氯化鈣 2ml 蒸餾水 40ml （ 3）方法與步驟： ① 將冰凍切片或福爾馬林固定的冰凍切片 水洗 ② 入孵育液，恒溫 37℃ ,孵育 2~3小時(shí)； ③ 1%CaCl2 液內(nèi)浸洗 。 （一）光鏡顯示方法 亞鐵氰化銅法 （ 1）原理：利用乙酰膽堿酯酶能將乙（或丁）酰硫膽堿鹽水解產(chǎn)生硫膽堿，使鐵氰化物還原為亞鐵氰化物，后者與銅離子結(jié)合成亞鐵氰化銅（ Copper ferrocy anide）而呈色沉淀。用毒扁豆堿硫酸酯 (eserine sulfate)3 10－ 5M代替蒸餾水，將切片處理 30分鐘，水洗后再入孵育液內(nèi)，則兩種酶均被抑制而呈陰性。最終 pH ~。 （ 5）對照： 去除底物吐溫 60（或 80），反應(yīng)即為陰性。 3）結(jié)果與評價(jià)： 酶活性部位呈黑色，胞核為綠色。 Ca2+激活的三磷酸腺苷酸 鈣 鈷法 （ 肌球蛋白型 ATPase Padykula和 Herman 1995） （ 1） 原理：此法類似堿性磷酸酶的鈣 鈷法， 但底物改用三磷酸腺苷鈉鹽 ， 最適 pＨ值為， 對 Mg2+型 ATPase起抑制作用 。 膜 ATP酶：又分為 Na+、 K+激活 ATPase 和 Mg2+激活 ATPase； 肌球蛋白 ATP酶：又稱 Ca2+激活 ATPase， 因?yàn)樗杀?Ca2+激活； 線粒體 ATP酶：由 Mg2+激活的ATPase （ 三 ） 光鏡顯示方法 Mg2+激活的三磷酸腺苷酶鉛法 （ 1） 原理： ATP酶分解 ATP釋放出來的磷酸離子被鉛離子捕獲 ， 通過形成硫化鉛沉淀顯色 。 (4)結(jié)果與評價(jià) : 棕色硫化鉛顆粒為活性所在部位。 四 、 葡萄糖－ 6－磷酸酶 (一 )名稱 常用名 : 葡萄糖－ 6－磷酸酶（ Glucose6 phosphatase Phosphohydro lase） 葡萄糖－ 6－磷酸酶是一種催化多種磷酸化合物水解的磷酸酶 。 ③ 入孵育液 ,恒溫 37℃
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