組化3第三章酶組化(完整版)
【正文】 ,孵育 20~60分鐘 。 5）說明： ACP是可溶性酶，以冷固定后結(jié)果 較滿 意 .石蠟切片制作過程易使酶 失活。 ACP也參與脂肪代謝。 ⑦ 蒸餾水洗 。2H2O） 20ml 5%硫酸鎂 (MgSO4 ? 酶反應(yīng)的溫度、時(shí)間、 PH必須控制好。 ? 組織化學(xué)中的酶反應(yīng)是指在一定的條件下，使組織細(xì)胞內(nèi)的酶通過作用于酶的底物，使后者被分解形成某種初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物，這種產(chǎn)物被捕捉劑所捕獲而沉淀于原位上，然后將這種沉淀物變成具有可見性的最終產(chǎn)物，從而間接證明酶的定位。 :是催化同分異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化的酶。 在運(yùn)輸較為活躍的細(xì)胞膜上廣泛分布 ，如毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 、 肝內(nèi)毛細(xì)膽管膜 、 腎近曲小管的刷狀緣 、 腸上皮的紋狀緣和神經(jīng)細(xì)胞的突觸膜等 。 ④ 2%（ Co(NO3) 2)5 min。 二、酸性磷酸酶 （一）名稱： 常用名： 酸性磷酸酶 （ acid phosphaatase, ACP） 主要位于細(xì)胞內(nèi)的溶酶體內(nèi)，是溶酶體 的標(biāo)志酶。 2) 染色步驟： ① 石蠟切片脫蠟到水；冰凍切片或冰凍切 片冷福爾馬林鈣固定 10 min后水洗； ② 入孵育液 2～ 4 h（肝組織 1 h左右）， 37℃ ； ③ 雙蒸餾水洗； ④ 入 1％硫化銨（新配）溶液內(nèi) 1～ 2 min ⑤ 流水洗。即：腺苷－５ ˊ－磷酸＋水 腺苷＋磷酸。 (4)結(jié)果與評(píng)價(jià) : 棕黑色硫化鉛沉淀為酶活性所在部位。 ③ 水洗； ④ 入孵育液 ,恒溫 37℃ ,孵育 5～ 20分鐘 。釋放出來的磷酸離子被鉛離子捕獲，而通過形成硫化鉛沉淀顯色。 (4)結(jié)果 : 酶活性處呈棕黑色硫化鉛沉淀 。－甘油磷酸鈉作底物。 ④ 1％ Pb(NO3)2浸 15分鐘 。證明酶活性的存在。 。 （ 2）孵育液的配制： 乙酰硫膽堿碘鹽 (acetyl thiocholine iodide) 5mg (acetate buffer) （ %）檸檬酸鈉 30mM()CuSO4 蒸餾水 1ml 5mM(%)鐵氰化鉀 (potassium ferricyanide) 1ml 乙酰硫膽堿碘鹽完全溶解于醋酸緩沖液后， 依次入其他溶液，臨用前不超過 30分鐘內(nèi)配制 ，充分混勻至溶液呈亮綠色。 (4)結(jié)果與評(píng)價(jià)： 磷酸黑色硫化鉛沉淀為酯酶活性所在部位。 （三）、光鏡顯示方法 偶氮色素法（偶聯(lián)偶氮色素法） 由于使用不同的重氮鹽，具體方法也不相同，現(xiàn)分述如下： (1) 萘酚 AS乙酸鹽（ Naphthol AS acetate）法 1）孵育液的配制： 1％ 萘酚 AS乙酸鹽 （ 丙酮溶液 ） （ pH ） 10ml 堅(jiān)牢藍(lán) B鹽 30mg （ 攪拌過濾使用 ） 2）方法與步驟： ① 新鮮組織恒冷箱切片，適當(dāng)固定； ② 入孵育液，室溫或 37℃ 恒溫孵育 20~30分鐘 ③ 流水輕沖洗 2分鐘； ④ 2％甲基綠復(fù)染細(xì)胞核； ⑤ 流水沖洗 3~5分鐘； ⑥甘油明膠封固。－甘油磷酸鈉代替底物，顯示染色反應(yīng)為堿性磷酸酶的定位。
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