酶工程3酶的分離純化(存儲版)
【正文】 下選擇性地與某些酶結(jié)合而形成沉淀。 基本原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定 pH下，可解離成帶電荷的離子，在電場作用下可以向與其電荷相反的方向的電極泳動，泳動速度主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及顆粒的大小和形狀。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE）是以聚丙烯酰胺作為支持物的一種電泳方法。 —— 目前已經(jīng)建立的方法有 親和層析法 和 親和電泳法 等。 表面變性法 —— 可將酶溶液與惰性液體混合，振蕩造成表面變性；如在酶液中加入氯仿，振蕩后通?？煞譃?3層：上面為未變性的酶，中層為乳濁狀的變性蛋白，下層為氯仿。 五、根據(jù)穩(wěn)定性的差異建立的分 離純化方法 — 熱變性法 — 酸堿變性法 — 表面變性法 熱變性法 —— 根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異，可以在較高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶則保持可溶狀態(tài)。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于 如果加入一種試劑消除電荷、形狀等因素的影響，使電泳遷移率只取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量。 等電聚焦電泳 高效毛細(xì)管電泳 毛細(xì)管電泳 是在內(nèi)徑為 25~100?m的石英毛細(xì) 管中進(jìn)行電泳，毛細(xì)管中填充了緩沖液或凝膠。 離子交換劑的 3種類型 —— 根據(jù)高分子支持介質(zhì)的性質(zhì) —— 離子交換樹脂 —— 離子交換纖維素 —— 離子交換球型多糖 (如葡聚糖凝膠 和瓊脂糖凝膠等 )。 有機(jī)溶劑： —— 常用的有機(jī)溶劑有丙酮，乙醇，甲醇，異丙醇等 離子強(qiáng)度 —— 大多數(shù)中性鹽在低濃度時(shí)能增加酶蛋白的溶解并減少變性，在有機(jī)溶劑沉淀中加入 5~10% （ ）的硫酸銨有助于提高分辨率。 凝膠過濾法 原理 ：又稱分子篩層析，在層析柱中填充凝膠介質(zhì)，加入待分離的酶溶液，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，樣品自上而下擴(kuò)展，大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入膠粒內(nèi)部而從膠粒間空隙擴(kuò)展，下移速度較快，而小于凝膠孔徑的分子進(jìn)入膠粒內(nèi)部，下移速度較慢，經(jīng)過一定時(shí)間后不同大小分子按先大后小的順序從層析柱中流出。 透析袋的預(yù)處理 ：干燥的透析袋在制備過程中曾用10%甘油處理過，只要浸泡濕潤和蒸餾水洗滌即可使用；必要時(shí)可用 10mmol/L 碳酸氫鈉， 50%乙醇和10mmol/L EDTA處理后，再用蒸餾水洗滌。 能從混合物中分離和純化出一種蛋白質(zhì)是因?yàn)椴煌鞍踪|(zhì)有著不同的物理和化學(xué)性質(zhì) 。 干燥 —— 將固體、半固體或濃縮液中水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水量較少的固體過程。 三、酶溶液的絮凝、凈化與脫色 絮凝 —— 由于發(fā)酵液黏度較大，細(xì)胞表面電荷排 斥以及多糖蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成的 水化層等給酶溶液的離心或過濾帶來困 難；因此要用絮凝劑進(jìn)行處理。 微生物胞外酶 可以用鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀成酶泥 胞內(nèi)酶 要先收集菌體，經(jīng)細(xì)胞破碎后提取 動物材料 應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織等 植物材料 應(yīng)去皮等以免單寧等物質(zhì)著色污染 細(xì)胞破碎： 物理和化學(xué)兩大類方法 物理破碎： — 研磨（手磨，球磨和石磨）， — 機(jī)械搗碎（勻漿器和高速組織搗碎器等）， — 高壓法， — 爆破性減壓法， — 專用波振蕩， — 快速冷凍融化法等。 酶的比活力 （ specific activity) 酶的比活力 是酶純度的量度，是指單位重量酶蛋白所具有的酶活力，單位為 IU/mg。 分離純化過程包括 3個基本步驟： 1 抽提 2 純化 3 制劑 Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984) 某些生化物質(zhì)在原料液中的 濃度與價(jià)格的關(guān)系 (1984年 ) 物質(zhì)名 濃度 (C) 價(jià)格 (P，＄ ) 尿激酶 5?10－ 5 3?108 熒光素酶 8?10－ 3 2?106 胰島素 4?10－ 1 9?104 頭孢菌素 10 102 乙醇 1?102 3?10－ 1 在分離純化中必須注意： 1 防止酶的變性失活； 2 在分離純化過程中的每一步都 應(yīng)檢測酶的活性，以確定酶的 純化程度和回收率。 終止反應(yīng)法 在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中，每隔一定時(shí)間，取出一定體積的反應(yīng)液，用強(qiáng)酸強(qiáng)堿或SDS以及加熱等使反應(yīng)立即停止，然后用化學(xué)法、放射性化學(xué)法或酶偶聯(lián)法分析產(chǎn)物的形成量或底物的消耗量。 二、抽 提 — 大多數(shù)酶蛋白是屬于球蛋白，因此，可用稀鹽、稀堿或稀酸的水溶液進(jìn)行抽提； — 抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其它物質(zhì)的連結(jié)。 四、酶溶液的濃縮 — 冷凍干燥法 — 蒸發(fā)法： — 超過濾法： — 膠過濾法： — 干燥 冷凍干燥法 —— 先將酶溶液凍成固體，然后在真空狀態(tài)下使
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