酶工程3酶的分離純化-全文預(yù)覽
【正文】 、 分子量 、 分子體積 、 極性 、偶極矩 、 熔點(diǎn) 、 沸點(diǎn) 、 汽化熱 、 離子電荷 、溶解度參數(shù) 、 折射率 、 表面張力 、 介電常數(shù) 、密度 、 粘度 、 酸堿強(qiáng)度 、 pK值 、 等電點(diǎn) (pI)等等 。 膠過濾法 —— 利用 Sephadex G250或G50吸水膨脹，而酶蛋白被排阻在膠的外面。 脫色 —— 酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過吸附色素而脫色；活性炭用量一般為%%。 溫度的選擇 —— 一般控制在 04 0C， 如果酶 比較穩(wěn)定可以例外。 （ II） 自溶 向菌體中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使細(xì)胞滲透性改變保持一定時(shí)間后可以使細(xì)胞自溶； （ III） 酶處理 用溶菌酶專一性地分解原核微生物細(xì)胞壁，使胞內(nèi)酶釋放 （ IV） 表面活性劑 膜結(jié)合的晶酶在細(xì)胞破碎后很難溶解，常借助于表面活性劑與脂蛋白形成微泡，使之溶解。 酶不可逆失活的原因和機(jī)理 蛋白質(zhì)（酶）的失活機(jī)理 蛋白質(zhì)不可逆失活的原因 蛋白酶水解 或自溶作用 表面活性劑 和去垢劑 聚合作用 氧化作用 機(jī)械力 變性劑 重金屬離子 和巰基試劑 冷凍和脫水 熱 極端 pH 蛋白質(zhì) 不可逆失活 脲和胍 高濃度鹽 螯合 有機(jī)溶劑 輻射作用 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化 蛋白質(zhì)穩(wěn)定化 蛋白質(zhì)穩(wěn)定化途徑 如何防止蛋白質(zhì)的可逆伸展 如何防止蛋白質(zhì)不可逆失活反應(yīng)發(fā)生 穩(wěn)定蛋白質(zhì)（酶）的方法 酶分離的一般流程 原料液 細(xì)胞分離 (離心，過濾 ) 細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物 路線一 路線二 細(xì)胞破碎 碎片分離 路線一 A 路線一 B 清液－胞外產(chǎn)物 粗分離 (鹽析、萃取、超過濾等 ) 純化 (層析、電泳 ) 脫鹽 (凝膠過濾、超過濾 ) 濃縮 (超過濾 ) 精制 (結(jié)晶、干燥 ) 包含體 溶解 (加鹽酸胍、脲 ) 復(fù)性 第二節(jié) 酶溶液的制備 酶溶液的制備： 把酶從生物原料中抽提出來，作成酶溶液 酶溶液的制備包括：材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎、抽提、凈化脫色、抽體液的濃縮等幾個(gè)步驟。 ? 酶活力的測定方法： １終止反應(yīng)法 ２和連續(xù)反應(yīng)法。 mol催化活性（分子活性）和 轉(zhuǎn)換數(shù)（催化中心活力） mol催化活性是指單位時(shí)間內(nèi)，每個(gè)酶分子所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目；轉(zhuǎn)換數(shù)（ Kcat)是指酶分子中每個(gè)活性中心所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目。第三章 酶的分離純化 酶分離純化的目的 酶分離純化的目的是使酶制劑產(chǎn)品達(dá)到應(yīng)用所需的純度。 酶活力單位 (enzyme activity unit) 表示酶活力大小的尺度； 一個(gè)國際單位（ IU） 是指在特定條件下（ 25 0C）， 每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化 1?mol底物或催化形成 1?mol產(chǎn)物所需的酶量 一個(gè) Kat是指每秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化 1mol底物所需的酶量， 1 Kat = 6?107 IU。比活力越大，酶純度越高。 連續(xù)反應(yīng)法 無須終止反應(yīng)，而是在酶反應(yīng)過程中用光化學(xué)儀器或電化學(xué)儀器等來監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行情況，對記錄結(jié)果進(jìn)行分析，然后計(jì)算出酶活力。 化學(xué)破碎： — 滲透作用 — 自溶： — 酶處理 — 表面活性劑 （ I） 滲透作用 將指數(shù)生長期的菌體用緩沖液洗凈，并懸浮于含蔗糖和 EDTA的稀 Tris緩沖液中，離心，加入 MgCl2劇烈攪拌，可使一些水解酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。 鹽的選擇 —— 大多數(shù)酶在低濃度的鹽溶液 中有較大的溶解度，一般選 擇等滲鹽溶液，如 mol/L的磷酸緩沖液或 mol/L的 NaCl等。 —— 絮凝劑：多種類型 無機(jī)：如醋酸鈣和磷酸鈣等 有機(jī)：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如殼多糖等 過濾或離心凈化 —— 通過絮凝劑處理后的酶溶液經(jīng)過離心或過濾將細(xì)胞碎片等固性物和雜蛋白，粘多糖，核酸以及脂類等大分子物質(zhì)去除。 超過濾法 —— 將酶溶液通過只允許小分子物質(zhì)通過的微孔濾膜，大分子的酶蛋白被截留而達(dá)到濃縮的目的。 —— 方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥 第三節(jié) 酶分離純化的基本過程 一、酶分離純化方法的選擇 目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異而建立的，在選擇分離純化方法時(shí)，要考慮以下幾個(gè)方面： ? — 首先對待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解； ? — 以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是否得當(dāng)； ? — 嚴(yán)格控制操作條件，防止酶的變性失活。 因此 ，生物體系的物化性質(zhì)的研究應(yīng)成為一個(gè)重點(diǎn) 。 這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目和序列不同造成的 。 酶分離純化方法 — 根據(jù)分子大小建立的分離純化方法 — 根據(jù)溶解度建立的分離純化方法 — 根據(jù)電荷性質(zhì)建立的分離純化方法 — 根據(jù)親和作用建立的分離純化方法 — 根據(jù)穩(wěn)定性差異建立的分離純化方法 ．．．．．． 一、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法 —— 透析
化學(xué)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1