酶工程3酶的分離純化-預(yù)覽頁
【正文】 —— 超過濾 —— 離心 —— 凝膠過濾等。 透析袋 酶溶液 蒸餾水 透析裝置和過程 超過濾 利用壓力或離心力強行使溶質(zhì)按大小形狀的差異分開，將所需的酶分子被濾膜截留，而其它較小的分子隨溶劑被壓到膜的另一側(cè)。 （ 1）離心機的種類和用途 （ 2）沉降系數(shù) S （ 3）離心方法的選擇 差速離心 密度梯度離心 等密度離心 （ 4）離心條件的確定 離心力 離心時間 離心溫度和 pH值 梯度離心 密度梯度 在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大 ,向上逐漸減小 蔗糖 便宜 ， 純度高 ， 濃溶液 （ 60％， w/w） 密度可達(dá) 。 凝膠過濾 凝膠過濾 Tubes march in from left A280 Fraction 部分使用的擔(dān)體 目前使用最廣泛的擔(dān)體材料： ※ 交聯(lián)后的葡聚糖凝膠 ※ 聚丙烯酰胺 ※ 瓊脂 ※ 其它物料 二、根據(jù)溶解度建立的分離方法 鹽析 (Salting Out)法 降低介電常數(shù)法（有機溶劑沉淀 法） 等電點沉淀法 共沉淀法 選擇性沉淀法： 鹽析法 最常用的是硫酸銨。 ? 直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表”。 pH值 —— 盡可能接近酶的等電點 pI 等電點沉淀法 —— 酶在等電點處容易發(fā)生沉淀 共沉淀法 —— 一些大分子非離子型聚合物如聚乙二醇（ PEG） ,聚乙烯亞胺（ PEI）單寧酸，硫酸鏈霉素以及表面活性劑（ SDS）等在一定條件下可以直接或間接與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀析出 ,再用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑溉芙獬鰜怼? （ 3）離子交換吸附法 —— 離子交換色譜法 —— 利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來。 電泳法 —— 在直流電場中，由于各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，移動速度不同，形成各自的區(qū)帶，用顯色劑如 Coomassie Blue染色后，可以在支持物上看到蛋白質(zhì)的顏色譜帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)。 粉末電泳 —— 以淀粉、纖維素粉或硅膠粉等為支持物的分離方法。 使用毛細(xì)管的一個 優(yōu)點 是 : 它減少了由于熱效應(yīng)產(chǎn)生的許多問題，因為管的孔徑小，面積與體積之比大，這樣可以提高熱散失，有助于消除由于熱引起的擴散增加而造成的對流和區(qū)帶變寬，因此管中不需要加入穩(wěn)定介質(zhì)即可進(jìn)行自由流動電泳。 ? 如果在 PAGE時加入適量十二烷基磺酸鈉 （ SDS） 可用于測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量； ? 如果 PAGE與等電聚焦相結(jié)合時 ， 可用于分析蛋白質(zhì)的等電點 。 凈電荷 分子的大小 形狀 等因素 （ SDSPAGE）的主要用途是 蛋白質(zhì)分子 量的測定 蛋白質(zhì)混合組分的分離 蛋白質(zhì)亞基組分的分析等 四、根據(jù)親和作用建立的純化方法 根據(jù)親和作用建立的純化方法 —— 由于酶對底物，競爭性抑制劑 ,輔酶等配體具有較高的親和力，而其它雜蛋白對這些配體則沒有或有很弱的親和作用，因此，可以根據(jù)酶與雜蛋白對配體親和力的差異，很容易地將酶分離出來。 親和層析中的配體構(gòu)成示意圖 Matrix: for ligand attachment, should be chemically and physically inert. Spacer arm: improve binding between ligand and target molecule by overing any effects of steric hindrance. Ligand: molecule that binds reversibly to a specific target molecule or group of target molecules. 親和體系的種類 體系 類 型 高特異性體系 抗原 — 單克隆抗體 荷爾蒙 — 受體蛋白 核酸 — 互補堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白 酶 — 底物、產(chǎn)物、抑制劑 群特異性體系 免疫球蛋白 — 蛋白 A、 蛋白 G 酶 — 輔酶 凝集素 — 糖 、 糖蛋白 、 細(xì)胞 、 細(xì)胞表面受體 酶 、 蛋白質(zhì) — 肝素 、 活性染料 、 過渡金屬離子 、 氨基酸 親和配基 (1) 酶的抑制劑 (2) 抗體 (3) 蛋白 A (4) 凝集素 (5) 輔酶和磷酸腺苷 (6) 三嗪類染料 (7) 過渡金屬離子 (8) 組氨酸 (9) 肝素 親和層析 1 親和層析 2 親和層析 3 親和層析過程示意圖 1. 用緩沖液平衡親和介質(zhì) 2. 樣品中的目標(biāo)分子被連接到親和介質(zhì)上，它們具有特異性吸附，但吸附是可逆的，可被洗脫下來。 酸堿變性法 —— 與熱變性原理類似，目的酶與雜蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的 pH使雜蛋白變性沉淀。
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