雙向凝膠電泳ppt課件(2)(存儲版)
【正文】 過高會使 IEF的速度降低。 第一步：用 Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白； 第二步：把未溶解的 pellet用標(biāo)準(zhǔn) IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白； 第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（ W/W）。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的 IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。 (防止低溫尿素結(jié)晶） IPG IEF 中的溫度 聚焦時(shí)間 ? 理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時(shí)間是 IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。如果用 TBP代替 DTT則只需一步平衡。后者最為常用 ， 其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等熒光染料 。 ? 該技術(shù)主要包括金屬鹽染料 、 鋅－咪唑染料等的使用 。 C – preferably onetimeuse aliquots of ~100 181。固定化 pH梯度膠已有商品生產(chǎn)，基本解決了重復(fù)性的問題； 2DPAGE的靈敏度 ?SDSPAGE有垂直板和水平超薄膠電泳兩種方法，可分離 10～ 100kD分子量的蛋白質(zhì)； ?銀染色法可檢測到 4ng蛋白，同位素標(biāo)記法最靈敏，可測定 20ppm的標(biāo)記蛋白。 ?利用 IPGphor II進(jìn)行第一向分離和 Ettan DALT垂直電泳儀進(jìn)行第二向分離，在一塊 2D膠上同時(shí)分離多達(dá)3個樣品。由于實(shí)驗(yàn)方法本身造成的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)強(qiáng)度的差異 ,比如樣品在進(jìn)入膠條時(shí)會有一些樣品損失 ,但在同一塊差異凝膠電泳膠上就不會出現(xiàn)這樣的差異。 ? 變性 2DPAGE：樣品先用 2%SDS＋ 5%βME＋ 95℃ 變性 5min，IEF在 8M尿素＋ 1%NP40條件下進(jìn)行 ， 之后膠條用 2%SDS＋5%βME平衡 ， 然后進(jìn)行 SDSPAGE。 ? 其中 SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料 。 ? 速度快 （ 5~15min） ， 蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如 EDTA或 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì) 。 ? 這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。 ? 但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與 SDS完整結(jié)合，從而在 SDSPAGE是電泳能順利進(jìn)行。 ? IPG膠條的 pH范圍 IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量 IPG Strip length Analytical Load (silver staining) Preparative Load (Coom staining) 7cm 10~100 ? g /125 ? l 200~500ug/125 ? l 11cm 50~200 ? g /185 ? l 250~1000ug/185 ? l 17cm 100~300 ? g/300 ? l 1~3mg/300 ? l IPG IEF 中 pH梯度的選擇 ? 常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗(yàn)確定。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。但該法需要專業(yè)儀器，有時(shí)會出現(xiàn)假陽性。 Carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。 增加樣品溶解性的手段 變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。 ? 防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 隨著聚丙烯酰胺凝膠的發(fā)明，雙向電泳支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向 聚丙烯酰胺凝膠，即雙向凝膠電泳。 ? 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。常用的表面活性劑有離子去污劑 SDS、非離子去污劑Triton X100和 NP兩性離子去污劑 CHAPS、OBG等。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同 pH范圍的 IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的 pH值與之相符合。 特殊樣品的制備 低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量 ， 但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷 ， 且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離 。通過這種方式生成的 IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的 IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。 ? 聚焦時(shí)間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 二維 SDSPAGE ? 同普通 SDSPAGE類似。 ? 這三種染料可對 SDSPAGE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色 ， 約 30~60min完成 ， 靈敏度為 2~10ng。 膠體擴(kuò)散染料 ? 主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和 PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。l ? Rehydrate slices with trypsin
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