《雙向凝膠電泳》ppt課件 (2)(文件)
【正文】 膠圖像可使用 3 種不同的激發(fā) P發(fā)射過濾器得到不同顏色熒光信號(hào) ,根據(jù)這些信號(hào)的比例來判斷樣品之間蛋白質(zhì)的差異 ,這樣可避免在匹配時(shí)出現(xiàn)的誤差 ,進(jìn)行定量分析時(shí)也不依賴于膠與膠之間的重復(fù)性。由于實(shí)驗(yàn)方法本身造成的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)強(qiáng)度的差異 ,比如樣品在進(jìn)入膠條時(shí)會(huì)有一些樣品損失 ,但在同一塊差異凝膠電泳膠上就不會(huì)出現(xiàn)這樣的差異。 2DPAGE的高通量與自動(dòng)化 Twodimensional gel electrophoresis in proteomics: Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains— T. Rabilloud (Proteomics 2022, 2, 310) 2D Gel Databases ? Biobase 角質(zhì)形成細(xì)胞 ,膀胱癌等 (丹麥 Center for Genome Research) ? ECO2DBASE 大腸桿菌 (在 NCBI庫中 ) ? Heart2DPAGE 人心肌 (德國柏林 ) ? HSC2DPAGE 人類心臟 (英國 Harefield, Heart Science Center) ? LSB 人類 ,小鼠和大鼠肝臟等 (美國 Large Scale Biology) ? QUESTRef52 細(xì)胞 ,大鼠胚胎 ,酵母 (美國 Cold Spring Harbor Lab) ? SWISS2DPAGE 十個(gè)人類圖譜 ,包括 : 肝 , 漿細(xì)胞 , 紅細(xì)胞 , 血小板 , 以及酵母 , 大腸桿菌 (瑞士日內(nèi)瓦 , University Hospital) ? Yeast S. cerevisiae, S. pombe等 (瑞典 Goteb University) ? Yeast S. cerevisiae (美國 Proteome Inc.) 雙向電泳分離技術(shù)的網(wǎng)路資源 國家生物醫(yī)學(xué)分析中心蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)（ NCBA）： 丁香園論壇： Biorad公司 ,BioRad Laboratories 中國生命科學(xué)論壇： 。 ?利用 IPGphor II進(jìn)行第一向分離和 Ettan DALT垂直電泳儀進(jìn)行第二向分離，在一塊 2D膠上同時(shí)分離多達(dá)3個(gè)樣品。 ?該方法的靈敏度可與銀染和 SYPRO Ruby 相媲美，可以檢測(cè)到100～ 200pg 的蛋白質(zhì) ,線形動(dòng)態(tài)范圍在 5個(gè)數(shù)量級(jí)左右。固定化 pH梯度膠已有商品生產(chǎn)，基本解決了重復(fù)性的問題； 2DPAGE的靈敏度 ?SDSPAGE有垂直板和水平超薄膠電泳兩種方法，可分離 10～ 100kD分子量的蛋白質(zhì)； ?銀染色法可檢測(cè)到 4ng蛋白，同位素標(biāo)記法最靈敏，可測(cè)定 20ppm的標(biāo)記蛋白。 ? 非變性 /還原 /SDS2DPAGE：非變性條件下 IEF聚焦 ， 之后用 8M尿素＋ 5%βME＋ 2%SDS進(jìn)行平衡 ， 再進(jìn)行第二向 SDSPAG電泳 。 C – preferably onetimeuse aliquots of ~100 181。 金屬螯合染料 ? 這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的 、 相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑 ， 其設(shè)計(jì)專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容 。 ? 該技術(shù)主要包括金屬鹽染料 、 鋅－咪唑染料等的使用 。 熒光染色的優(yōu)缺點(diǎn) ? 對(duì)蛋白無固定作用 ? 與質(zhì)譜兼容性好 ? 靈敏度較高與銀染相仿 ? 線性范圍遠(yuǎn)高于銀染 ? 與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，可能改變蛋白的遷移性能 ? 熒光淬滅 ? 降低蛋白溶解度 用 SYPRO Ruby對(duì) 2D電泳后的膠染色圖 利用 Sypro Ruby染色后的 2D膠分析圖譜 SYPRO Ruby進(jìn)行染色的優(yōu)缺點(diǎn) ? 靈敏度高：比銀染高 3～ 30倍 ? 線性動(dòng)態(tài)范圍廣 ? 不對(duì)核酸染色（熒光染料 SYPRO Rose染核酸） ? 染色時(shí)間不嚴(yán)格，用擔(dān)心染色過度 ? 不干擾后續(xù)的質(zhì)譜及免疫學(xué)檢測(cè) ? 染料本身及掃描儀價(jià)格昂貴 Comparison of fluorescent labeled 2D gel with silver staining CyTM5 labelled gel Silver stained gel E. coli lysate, 50?g loading, pH 47 負(fù) 染 ? 能專門提高 PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率 ， 但不能用于膜上染色 。后者最為常用 ， 其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等熒光染料 。 ? 膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn) PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為 8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。如果用 TBP代替 DTT則只需一步平衡。 IEF的基本條件
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