雙向凝膠電泳ppt課件(2)-免費(fèi)閱讀
【正文】 ?不同的 CyDye（ Cy2, Cy3, Cy5）標(biāo)記的樣品可以在同一塊膠上共分離，保證所有樣品在完全相同的第一向和第二向電泳條件下分離，消除實(shí)驗(yàn)的偏差并保證精確的膠內(nèi)匹配。 該技術(shù)適于 DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析 ， 或分析被碳?xì)滏I連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性 ， 但此方式顯示的大于 100Kd的蛋白質(zhì)點(diǎn)少于第三種方式 雙向電泳的分類 2DPAGE Strongpoints ?Control and experimental samples in the same gel ?Differencial expression analysis ?Reproducibility ?Reliability Statistically ?High Sensitivity ?Effectivity: a relatively large number of proteins ?Simple and relatively economical pared to LC 2DPAGE的分辨率和重復(fù)性 ?目前，一塊膠板 (16cm 20cm)可檢測到3000～ 4000個(gè)甚至 10000個(gè)蛋白斑點(diǎn)； ?80年代開始采用固定化 pH梯度膠的 IEF，克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點(diǎn)而得以建立非常穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的 pH梯度，可建立很窄的 pH范圍 ()，對特別感興趣的區(qū)域做第二輪分析，大大提高了分辨率。 EXCISE ? Automated instrumentation ? Manual excision – trim slice to ~1mm3 *Run proper controls ?negative gel ?reagent alone WASH ? Organic/Aqueous – This will remove excess Coomassie Blue DEHYDRATE ? Soak in 100% acetonitrile, then remove – slices turn opaque white – be sure that acetonitrile is free of acid ? Dry slices in speedvac or lyophilizer – remember to wear gloves as the samples will be uncovered DIGEST ? Stocks of trypsin can be stored at 70176。 ? 它主要適用于蛋白質(zhì)顯色 、 完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析 。 The Silver Stained 2DE Map of Rat Liver Mitochondrial Protein 3 ← pH → 10 4 ← pH → 7 400ug IEF: pH3－ 10 NL SDSPAGE ％ 200ug IEF: pH4－ 7 SDSPAGE 10％ 有機(jī)熒光團(tuán)染料 ? 包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類 。 ? 建議方案是： 用含 2%(m/v)SDS、 1%(m/v)DTT、 6mM尿素和30%甘油的 50mM Tris（ ）緩沖液先平衡15min，再用 5%(m/v)碘乙酰胺取代 DTT后的上述緩沖液平衡 15min。 ?溫度的選擇 ： 20176。 一維固相 pH梯度等電聚焦（ IEF with IPG）： ? IPG膠的材料是 Immobilines，為擁有CH2=CHCONHR結(jié)構(gòu)的 8種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在 pH3~10不同值的緩沖體系。 ?順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于 ％（ w/v)。其典型代表是尿素和硫尿。 ? 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。第八課 雙向凝膠電泳 ? 概述 ? 原理 IEF， SDSPAGE ? 雙向凝膠電泳分離操作 ? 雙向凝膠電泳檢測 ? 雙向電泳分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn) ? DI GE技術(shù) 一、雙向凝膠電泳概述 雙向電泳的思路最早由 Smithies和 Poulikc提出，蛋白質(zhì)第 一向電泳是根據(jù)其自由溶液遷移率 (freesolutionmobility)， 在濾紙條上進(jìn)行；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠 上進(jìn)行。 ? 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。濃度
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